Holen Sie sich zunächst den auf der Probe montierten Objektträger, nachdem Sie ihn gealtert haben. Um den Objektträger vorzubehandeln, tauchen Sie ihn für die angegebene Zeit nacheinander in Coplin-Gläser mit geeigneten Lösungen. Verdauen Sie das Gewebe mit 100 bis 200 Mikrolitern Proteinase-K-Verdauungspuffer und inkubieren Sie es eine Minute lang bei Raumtemperatur.
Um den Aufschluss zu stoppen, tauchen Sie den Objektträger sofort nacheinander für jeweils zwei Minuten in Ethanollösungen. Tragen Sie die FISH-Hybridisierungsmischung auf den Objektträger auf und decken Sie die Probe mit einem Deckglas ab. Legen Sie die Objektträger für zwei bis fünf Minuten auf eine heiße Platte, z. B. ein Slide Moat-Hybridisierungssystem bei 75 Grad Celsius.
Übertragen Sie dann den Objektträger auf eine andere auf 37 Grad Celsius eingestellte Kochplatte, um über Nacht zu hybridisieren. Tauchen Sie anschließend den Objektträger in den Warmwaschpuffer und entfernen Sie vorsichtig den Deckglas. Waschen und färben Sie den Objektträger mit geeigneten Reagenzien im Dunkeln.
Tauchen Sie die Rutsche schnell für nicht länger als eine Sekunde in entionisiertes Wasser und legen Sie sie auf ein Papiertuch. Montieren Sie die Folie nach dem Trocknen mit lichtbeständigen Montagemedien. Platzieren Sie den Deckglas und versiegeln Sie es mit Nagellack, bevor Sie es fotografieren.
Erfassen Sie mit einer 60-fachen Öllinse das Fluoreszenzsignal in mehreren Z-Stapeln. Führen Sie abschließend eine maximale 3D-Projektion durch, um die beste Auflösung zu erzielen, und wenden Sie Dekonvolution oder andere Algorithmen zur Hintergrundlöschung an. In den dreifach negativen Brustkrebsproben zeigt der nukleäre FISH hauptsächlich zwei unterschiedliche Punkte pro Zellkern, die ihre beiden ERBB2-Signale repräsentieren.
Im Gegensatz dazu weisen HER2-positive Proben reichlich FISH-Signale auf, was auf unterschiedliche Muster der Genamplifikation hinweist. Darüber hinaus können einige Zellkerne in HER2-positiven Proben Cluster aufweisen, was auf zusätzliche chromosomale DNA-Hubs hindeutet, die Brennpunkte für eine erhöhte Genamplifikation darstellen.
