Ordnen Sie zunächst frisch vorbereitetes Expansionsmedium an, filtrieren Sie sterilisierte Proteinase- und Antibiotikalösungen sowie sterilisierte chirurgische Instrumente auf der Arbeitsplattform der Biosicherheitswerkbank. Geben Sie Rattenschwanzkollagen in 100-Millimeter-Kulturschalen und 24-Millimeter-Trans-Wells. Lassen Sie das Geschirr zur Sterilisation über Nacht unter ultraviolettem Licht geöffnet.
Tauchen Sie die euthanasierte Maus zur Sterilisation in 75%iges Ethanol. Tauchen Sie Nase und Mund nicht ein. Schneiden und öffnen Sie mit einer chirurgischen Schere und Pinzette die Epidermis vom Unterkiefer bis zur Bauchhöhle der Maus.
Reißen Sie mit einer weiteren chirurgischen Schere und Pinzette die Schilddrüse auf beiden Seiten auseinander und entfernen Sie die Verbindungen zwischen der Luftröhre, dem umgebenden Muskelgewebe und der Speiseröhre. Schneiden Sie dann vorsichtig in die Brust und verwenden Sie eine Pinzette, um tiefer in die Brusthöhle einzudringen. Entferne die gesamte Lunge und finde das Ende der Luftröhre.
Schneiden Sie die Luftröhre vom Schilddrüsenknorpel bis zum trachealen Bronchialast heraus und legen Sie sie in ein vorkaltes Expansionsmedium, das vier Antibiotika enthält. Schütteln Sie den Schlauch, um so viel Blut wie möglich von der Oberfläche der Luftröhre zu spülen, bevor Sie ihn auf Eis legen. Übertragen Sie nun die Luftröhre auf ein PBS vor der Erkältung, das vier Antibiotika enthält.
Entfernen Sie mit einer chirurgischen Schere und Pinzette Gerinnsel und anderes Gewebe von der Oberfläche der Luftröhre und schneiden Sie sie auf einen Quadratzentimeter Größe. Inkubieren Sie das Trachealgewebe in Proteinaselösung bei 37 Grad Celsius. Schütteln Sie das Röhrchen nach 40 Minuten mehrmals und verwenden Sie ein 40-Mikron-Zellsieb, um das restliche Gewebe zu entfernen.
Spülen Sie die gehackte Luftröhre auf einem Sieb mit fünf Millilitern Expansionsmedium ab. Zentrifugieren Sie die Trachealsuspension fünf Minuten lang bei 400 g bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Pellet in acht Millilitern Expansionsmedium. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und dem Hämozytometer.
Platte P0-Zellsuspension auf einer 100-Millimeter-Schale, vorbeschichtet mit Rattenschwanzkollagen. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
