Sobald die primären Atemwegsepithelzellen der Maus eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, setzen sich die Zellen auf einen Glasobjektträger, der mit Rattenschwanzkollagen beschichtet ist. Fügen Sie dann Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen 12 Stunden lang zu fixieren. Waschen Sie den Objektträger dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS und inkubieren Sie ihn eine Stunde lang mit 3 % Rinderserumalbumin und 0,1 % Triton X-100 in PBS.
Geben Sie einen Anti-Pan-Cytokeratin-Antikörper in einer Verdünnung von eins bis 500 auf den Objektträger und inkubieren Sie ihn über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie den Objektträger am nächsten Tag dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS-Lösung, bevor Sie ihn zwei Stunden lang im Dunkeln mit einem Sekundärantikörper in einer Verdünnung von eins bis 1.000 inkubieren. Nach dem Waschen des Objektträgers mit PBS DAPI in einer Verdünnung von eins bis 1.000 hinzufügen und 15 Minuten inkubieren.
Waschen Sie den Objektträger einmal fünf Minuten lang mit PBS. Betrachten Sie den Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Expressionsmuster mit einer Positiv- und einer Negativkontrolle zu vergleichen. Nach der Ablösung und Zentrifugation werden die P2-Phasenzellen in einem geeigneten Volumen des Expansionsmediums wieder suspendiert. Pipettieren Sie einen Milliliter Zellsuspension in die apikale Kammer des Transwell-Polycarbonat-Membraneinsatzes.
Geben Sie 1,5 Milliliter Proliferationsmedium in das basale Kompartiment des Transwells. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, bis die Konfluenz erreicht ist. Bereiten Sie 50 Milliliter vollständiges Differenzierungsmedium mit den folgenden Komponenten vor.
Blasen Sie eine Zigarette durch 12,5 Milliliter Differenzierungsmedium und filtrieren Sie sie dann durch einen 0,22-Mikron-Eingießfilter, um Zigarettenrauchextrakt oder CSE herzustellen. Um eine Standardisierung zwischen Experimenten und CSE-Chargen zu gewährleisten, messen Sie die Absorption bei 320 Nanometern mit einem Spektralphotometer. Entfernen Sie anschließend das Expansionsmedium aus der apikalen und basalen Kammer von Transwells.
Fügen Sie ein Differenzierungsmedium hinzu, das eine angemessene Konzentration an CSE enthält, um primäre murine Atemwegsepithelzellen für 28 Tage zu stimulieren. Während der Inkubation wird die apikale Kammer zweimal wöchentlich mit PBS gewaschen und das Medium in der Basalkammer durch frisch zubereitetes CSE-haltiges Differenzierungsmedium ersetzt. Die Epithelzellen der murinen Atemwege differenzierten sich innerhalb von 28 Tagen erfolgreich an einer Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit.
Das Vorhandensein von Flimmer- und Becherzellen wurde durch Immunfluoreszenz-Assay des Zilienmarkers, acetyliertem Alpha-Tubulin, bzw. des Becherzellmarkers Mucin 5AC nachgewiesen. Die Zellviabilität nach 24 Stunden mit unterschiedlichen CSE-Konzentrationen zeigte, dass Epithelzellen abnahmen, wenn die Konzentration höher als 6 % war. Die Zellaktivität unter Langzeitstimulation zeigte keinen signifikanten Zelltod mit 2 %4 %- und 6 %CSE-Konzentrationen. Es wurden jedoch Veränderungen der Transmembranresistenz und der exfoliierten Zellen festgestellt.
Darüber hinaus wurde eine allgemeine Verringerung der differenzierten Zellen und Flimmerzellen festgestellt, wenn murine Atemwegsepithelzellkulturen chronisch CSE ausgesetzt waren.
