Besorgen Sie sich zunächst eine Kulturplatte mit Methylomonas-Spezies LW13-Kolonien. Beimpfen Sie die Kolonien mit sechs Millilitern Nitrat-Mineralsalzmedium in einem Glasröhrchen. Verschließen Sie das Röhrchen mit einem Serumstopfen und einem Aluminium-Bördelverschluss.
Fügen Sie Methan mit einer Spritze hinzu, um eine Endatmosphäre von 50 Vol.-% Methan in der Luft zu erzeugen. Schütteln Sie diese planktonische Flüssigkultur bei 200 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur, bis sie trüb ist, was etwa einen Tag dauert. Die Flüssigkulturen werden im Verhältnis eins zu 10 in frische Medien überführt.
Die Flüssigkulturen von Methanotrophen werden weiter gezüchtet, um das Phasenwachstum zu protokollieren und eine optische Dichte bei 600 Nanometern von etwa 0,5 zu erreichen. Um die Spritze vorzubereiten, entfernen Sie die mitgelieferten Kolben und legen Sie sie in einen sterilen Behälter. Befestigen Sie an jeder Spritze eine sterile Filterspitze aus Polytetrafluorethylen oder PTFE und legen Sie die Spritze mit der Spitze nach unten in ein Standard-Reagenzglasgestell.
Mischen Sie dann einen Milliliter der Zellen mit fünf Millilitern Nitrat-Mineralsalzmedium und vier Millilitern geschmolzener Agarose in einem sterilen konischen Röhrchen. Gießen Sie die Agarosemischung langsam bis zur Acht-Milliliter-Marke in die Spritze und lassen Sie sie fest werden. Nach ca. 15 Minuten verschließen Sie die Spritze mit einem sterilen 20-Millimeter-Gummi-Butylstopfen.
Befestigen Sie die Stopfen mit Laborklebeband und beschriften Sie die Spritze. Füllen Sie anschließend eine große 60-Milliliter-Spritze mit 100 % Methan und befestigen Sie eine PTFE-Filterspitze, die mit einer sterilen 23-Gauge-Nadel verbunden ist. Den Gummistopfen der Spritze mit dem Agarosegemisch mit einer großen Spritze durchstechen und eine zweite sterile Nadel als Gasauslass einführen.
Drücken Sie den Kolben der großen Spritze, damit 20 Milliliter 100%iges Methan durch den Kopfraum spülen können. Entfernen Sie die Auslassnadel, wenn sich noch ein bis zwei Milliliter Methan in der Spritze befinden, um einen Sauerstoffrückfluss zu verhindern. Inkubieren Sie die Spritze mit Agarosegemisch und Methan bei 18 Grad Celsius.
Um die Agarose zu extrudieren, ersetzen Sie die PTFE-Filterspitze durch eine sterile 23-Gauge-Nadel und den Gummistopfen durch den mitgelieferten Spritzenkolben. Drücken Sie langsam auf den Kolben, um einen Milliliterschritt in separate sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu geben. Der Wildtyp-Stamm LW13 bildete ein deutliches horizontales Band in einer bestimmten Tiefe in der Gradientenspritze, in der sowohl die Methan- als auch die Sauerstoffkonzentrationen niedrig waren.
LW13, das in Gradientenspritzen geimpft wurde, zeigte einen Methan-Sauerstoff-Gegengradienten mit Methanabbau und Sauerstoffverbrauch, der der Tiefe des horizontalen Bandes entsprach. Der OAT-Deletionsmutante von LW13 fehlte die ausgeprägte horizontale Bandenbildung, die im Wildtyp-Stamm beobachtet wurde, was auf die Rolle des Gens bei diesem Phänotyp hinweist.
