Zu Beginn erhalten Sie die extrudierten Agarosesegmente aus Gradientenspritzen, die entweder mit der Wildtyp- oder der mutierten Methylomona-Spezies LW13 geimpft wurden. Geben Sie 0,75 Milliliter 0,85 % Natriumchlorid in Wasser zu der extrudierten Agaroseprobe und homogenisieren Sie sie durch Vortexen. Verdünnen Sie ferner die Probe 1 bis 10 in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 Mikrolitern Salzlösung.
Inkubieren Sie die Proben mit drei Mikrolitern einer Eins-zu-Eins-Mischung aus SYTO 9 und Propidiumiodid-Färbungen im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Um die Zellen pro Milliliter Agarose zu bestimmen, beschallt man die Mikrosphären-Zählperlensuspension fünf Minuten lang in einem Wasserbad. Geben Sie dann 10 Mikroliter der Suspension vor der durchflusszytometrischen Analyse in die Probe.
Analysieren Sie Proben mit einem Durchflusszytometer. Vergleichen Sie Side-Scatter- und Forward-Scattered-Op-Plots zwischen zellfreien Kontrollproben und inokulierten Agarose-Proben, um bakterielle Event-Voltage-Gates zu zeichnen, die Hintergrund-Agarose-Partikel ausschließen. Um koloniebildende Einheiten in der Gradientenspritze zu zählen, geben Sie 800 Mikroliter Nitrat-Mineralsalzmedium in das extrudierte Agarosesegment und den Vortex für 10 Sekunden, um das Pipettieren zu unterstützen.
Bereiten Sie eine sterile 96-Well-Platte mit 180 Mikrolitern Nitrat-Mineralsalzmedium in jeder Vertiefung vor. Geben Sie 20 Mikroliter verdünnte Agaroseprobe in jede Vertiefung in der ersten Säule und mischen Sie. Verdünnen Sie mit einer Mehrkanalpipette seriell 20 Mikroliter Proben zehnfach, beginnend mit der ersten Well-Reihe.
Beschriften Sie eine quadratische Gitterplatte, die Nitrat, Mineralsalze, Schnecke oder Medien Ihrer Wahl enthält. Sprühen Sie mit einer Mehrkanalpipette fünf Mikroliter aus einer Säule der 96-Well-Platte auf die Schneckenplatte. Die Durchflusszytometrie mit den extrudierten Agaroseproben bestätigte, dass die OAT-Deletionsmutante von LW13 im Vergleich zum Wildtyp-Stamm ein reduziertes Zellwachstum zeigte.
Die Komplementation der Mutante mit dem OAT-Gen stellte die Zellzahl und die Bandenbildung auf ein ähnliches Niveau wie beim Wildtyp wieder her, was auf die spezifische Rolle des Gens bei der Bandenbildung hinweist.
