Geben Sie zunächst in einer Zellkulturhaube das geerntete Lipoaspirat in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Übertragen Sie das Lipoaspirat in eine sterile 20-Milliliter-Luer-Lock-Spritze. Befestigen Sie dann einen 1,4-Millimeter-Konnektor an der Spritze.
Befestigen Sie nun eine zweite 20-Milliliter-Luer-Lock-Spritze an der kontralateralen Seite des Konnektors. Schieben Sie das Fettgewebe etwa 30 Mal von einer Spritze in die andere. Dann überträgst du das emulgierte Fett in ein frisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Zentrifuugieren Sie das Fett bei 500 g für 10 Minuten. Entsorgen Sie dann die ölige Deckschicht. Entnehmen Sie die zentrale gereinigte Schicht, die die getrennte stromale Gefäßschicht enthält, und überführen Sie sie in ein frisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Füllen Sie nun das Zentrifugenröhrchen mit supplementiertem DMEM bis zur 40 Milliliter-Marke. Das Röhrchen wird erneut fünf Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Sammeln Sie die resultierende mSVF-Schicht und übertragen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Pipettieren Sie 100 Mikroliter der isolierten stromalen Gefäßfraktion in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie dazu 10 Mikroliter Thrombin hinzu und pipettieren Sie dann 10 Mikroliter Calciumchlorid. Zum Schluss fügen Sie der Mischung 70 Mikroliter Tranexamsäure hinzu.
Geben Sie mit einer frischen Pipettenspitze kurz vor der Anwendung 10 Mikroliter Fibrinogen in das Röhrchen. Nach der Polymerisation der mSVF-Hydrogelmischung pipettieren Sie 200 Mikroliter des Hydrogels zu Analysezwecken in eine 12-Well-Platte. Geben Sie nun 100 Mikroliter des Fibrinhydrogels als Negativkontrolle in eine Vertiefung.
Inkubieren Sie die 12-Well-Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxid. Geben Sie dann einen Milliliter vorgewärmtes Nährmedium in jede Vertiefung. Legen Sie die 12-Well-Platte wieder für vier Stunden in den Inkubator.
Geben Sie einen Milliliter Resazurin in jede Vertiefung, bevor Sie erneut 24 Stunden lang inkubieren. Pipettieren Sie die Resazurin-Proben in eine 96-Well-Platte. Verwenden Sie am nächsten Tag einen Multi-Mode-Mikroplatten-Reader für die Zellbildgebung, um die erste Fluoreszenzintensität zu messen.
Für die histologische Analyse an den Tagen eins, drei und sieben inkubieren Sie das Fibrin-Hydrogel in 0,5 Millilitern 4%-Paraformaldehyd. Geben Sie nun 1%PBS auf den Teller und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius. Der Resazurin-Assay wurde durchgeführt, um die in vitro Zellviabilität der vaskulären Fraktion und des Hydrogels zu quantifizieren.
Die vaskuläre Fraktion zeigte am dritten Tag eine verminderte Viabilität, während die mSVF-Fibrin-Hydrogel-Kombination nahe dem Ausgangswert blieb. Am siebten Tag sank die Lebensfähigkeit des mSVF, während die Kombination aus mSVF und Fibrin-Hydrogel zunahm. Die histologische Analyse zeigte an den Tagen drei und sieben keine Verringerung der Anzahl der Zellkerne.
Das Fibrinhydrogel zeigte einen minimalen Abbau mit gleichmäßig verteilten sichtbaren Zellclustern.
