Gewinnen Sie zunächst menschliche Mikroglia aus den menschlichen embryonalen Stammzellen und ernten Sie sie am Tag 56. Für die Gewinnung von Netzhaut-Organoiden kultivieren Sie die menschlichen embryonalen Stammzellen in einem Stammzellmedium, bis die Zelldichte 80 bis 90 % erreicht. Geben Sie einen Milliliter Dispase pro Vertiefung in die Kulturzellen und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach dem Entfernen der Dispase einen Milliliter Medium D in jede Vertiefung geben.
Schneide die Zellen in kleine Stücke. Sammeln Sie mit einer 10-Mikroliter-Pipette vorsichtig alle Zellstücke und das Medium in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 x g für fünf Minuten.
Nach dem Entfernen des Überstands werden die Zellen in 200 Mikrolitern einer kalten Matrix vorsichtig wieder suspendiert. Stellen Sie das 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für 20 Minuten in einen Inkubator. Nach 20 Minuten im Inkubator verfestigt sich die Matrix.
Bereiten Sie eine 10 Zentimeter große Schale mit 15 Millilitern Medium D vor. Suspendieren Sie die Matrize mit Medium D und schütteln Sie die Petrischale vorsichtig. Stellen Sie das Gericht für fünf Tage in einen Inkubator. Ersetzen Sie am 12. Tag das Medium durch drei Milliliter Dispase.
Nach fünf Minuten aspirieren Sie die Dispase und fügen Sie 15 Milliliter Medium E hinzu. Geben Sie die geernteten Mikroglia an Tag 12 in verdaute Netzhautorganoide. Schwenken Sie die Platte an Tag 19 vorsichtig, um die Organoide in die Mitte der Schale zu aggregieren, und ersetzen Sie das Medium E durch das mittlere F. Übertragen Sie schließlich die Organoide mit dem Medium F in eine neue Suspensionsschale. Am 30. Tag zeigten retinale Organoide, die mit Mikroglia kokultiviert wurden, eine signifikante GFP-Autofluoreszenz, was auf das Vorhandensein von Mikroglia hinweist.
Die co-kultivierten retinalen Organoide zeigten deutliche Immunfluoreszenzsignale für den Photorezeptormarker CRX und den Mikrogliamarker IBA1.
