Zu Beginn äquilibrieren Sie das Gesamttriglycerid-Kit 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Sammeln Sie den Überstand der über Nacht gewachsenen Hep G2-Zellen und zentrifugieren Sie ihn 10 Minuten lang bei 1.570 g. Legen Sie den Standard fest und testen Sie die Probenvertiefungen.
Geben Sie 50 Mikroliter der Ölsäure in die standardmäßig gekennzeichneten Vertiefungen. Zusätzlich zu den Blind- und Standard-Wells geben Sie 10 Mikroliter Zellkultur in die Proben-Wells. Geben Sie dann 40 Mikroliter Probenverdünnungsmittel in jede Vertiefung.
Geben Sie nun 100 Mikroliter Nachweisantikörper und Meerrettichperoxidase in jede Vertiefung. Mit einer Plattenmembran verschließen und bei 37 Grad Celsius in einem Ofen mit konstanter Temperatur inkubieren. Nach einer Stunde den Überstand entsorgen und auf staubfreiem Papier trocken tupfen.
Waschlösung in jede Vertiefung geben und eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie nun 50 Mikroliter Substrat A und 50 Mikroliter Substrat B in jede Vertiefung. Vorsichtig mischen und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Fügen Sie 50 Mikroliter Terminierungslösung hinzu und messen Sie innerhalb von 15 Minuten die optische Dichte bei 450 Nanometern. Plotten Sie die Konzentration des Standards entlang der x-Achse und den entsprechenden Absorptionswert entlang der y-Achse. Führen Sie eine lineare Regression durch und leiten Sie die Kurvengleichung ab, um den Konzentrationswert jeder Probe zu berechnen.
Im Vergleich zur Kontrollgruppe führte die Behandlung von Hep G2-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ölsäure zu einem signifikanten Anstieg des Gesamttriglyceridgehalts des Zellüberstandes.
