Führen Sie zunächst eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch, um die gewünschte Region der gewebeextrahierten DNA zu amplifizieren. Bringen Sie den Mastermix, den Puffer und das doppelt destillierte Wasser des Sequenzierungsamplifikationsenzyms auf Raumtemperatur und starten Sie sofort. Nachdem Sie die Röhrchen für die Sequenzierung vorbereitet haben, legen Sie das PCR-Röhrchen zur Amplifikation auf das voreingestellte PCR-Instrument.
Nehmen Sie dann das Produkt aus dem PCR-Gerät und bewahren Sie die Reaktionsprodukte lichtgeschützt im Kühlschrank auf. Wirbeln Sie die magnetischen Kügelchen gründlich ein. Geben Sie 10 Mikroliter magnetische Kügelchen und 40 Mikroliter 80 % Ethanol auf die 96-Well-Platte und versiegeln Sie die Platte mit einer Folie.
Legen Sie die 96-Well-Platte für 10 Sekunden auf einen Vortex-Shaker, um die Kügelchen vollständig zu suspendieren und zu mischen. Befestigen Sie dann die Platte mit einem Gummiband an einem horizontalen Oszillator und vibrieren Sie drei bis fünf Minuten lang auf der maximalen Einstellung. Legen Sie anschließend die PCR-Platte auf einen Magnetständer und stellen Sie sicher, dass sie fest angedrückt ist.
Halten Sie den Ständer für die statische Adsorption drei Minuten lang bei vier Grad Celsius. Sobald die Kügelchen adsorbiert sind, entfernen Sie die Deckenfolie und gießen Sie die Abfallflüssigkeit aus. Spülen Sie die Kügelchen zweimal mit 40 Mikrolitern 80%igem Ethanol aus.
Legen Sie die Platte nach dem Abgießen der Abfallflüssigkeit auf saugfähiges Papier und tupfen Sie sie vorsichtig trocken. Legen Sie das saugfähige Papier mit der Magnetplatte in eine Zentrifuge und drehen Sie es kurz bei 120 g. Nachdem du den Alkohol entfernt hast, stellst du die Platte für drei bis fünf Minuten bei 60 Grad Celsius in einen Ofen, um die Kügelchen vollständig zu trocknen.
Als nächstes gibst du 40 Mikroliter reines Wasser auf die Platte und versiegelst sie mit einer Folie. Schütteln Sie es drei bis fünf Sekunden lang auf einem Vortex-Shaker und stellen Sie die Platte auf einen horizontalen Shaker. Befestigen Sie es und lassen Sie die Platte drei bis fünf Minuten lang schütteln, um das gereinigte Sequenzierungsprodukt aufzulösen.
Zum Schluss wird das gelöste Sequenzierprodukt bei 180 g geschleudert und für die genomische Analyse mittels Kapillarelektrophorese verwendet. Mit dieser Methode konnten die bekannte RHOA G17V-Mutation und andere niederfrequente Mutationen im Amplifikationsintervall von Upstream- und Downstream-Primern nachgewiesen werden. Auch Mutationen in zwei weiteren Genen, nämlich IDH2 und JAK1, wurden mit dieser Methode korrekt analysiert.
