Färben Sie zunächst die murinen Knochenmarkzellen mit Hoechst 33342. Starten Sie für die Durchflusszytometrie die erforderliche Software und wählen Sie dann die QC-Standardisierung aus. Setzen Sie das Qualitätskontroll- oder QC-FluoroSphere-Probenröhrchen in den Röhrchenhalter ein, bevor Sie Start auswählen, um den QC-Vorgang zu starten.
Um ein neues Experiment zu erstellen, klicken Sie im Menü Datei auf Neues Experiment, geben Sie den Dateipfad an und speichern Sie das Experiment. Wählen Sie dann im Menü "Einstellungen" die Option "Kanal einstellen". Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Kanalsignal und fügen Sie den Namen des Reagenzes in der Beschriftungsspalte hinzu.
Klicken Sie anschließend auf das Symbol für Pseudofarbdiagramme im Zeichnungsbereich, um Diagramme zu erstellen. Klicken Sie im Bildschirm für das Reagenzglas auf Röhrchen hinzufügen, um neue Probenröhrchen zu erstellen und deren Namen zu ändern. Wählen Sie dann Ausführen aus, um die Stichprobe zu laden, die Diagramme anzuzeigen und die Gates einzurichten.
Passen Sie die Verstärkungs- und Schwellenwerteinstellungen an und wählen Sie Aufnahme, um die Daten zu speichern. Um die Logik der Gattereinstellung zu entwerfen, klicken Sie auf die X-Achse, um FSEW auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse, um FSEA auszuwählen. Wählen Sie Polygon-Gatter aus, um Tor A so zu zeichnen, dass die einzelne Zelle eingekreist und anhaftende Zellen ausgeschlossen werden.
Klicken Sie für das zweite Diagramm auf die X-Achse, um FSEA auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse, um SSEA auszuwählen. Wählen Sie Polygon-Gate aus, um Gate B zu zeichnen, um nicht-fragmentäre Zellen zu trennen und zelluläre Trümmer auszuschließen. Klicken Sie für das dritte Diagramm auf die X-Achse, um PIA auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse, um SEA auszuwählen.
Nachdem Sie das Tor B gezeichnet haben, wählen Sie lebende Zellen mit negativem Propidiumiodid aus und ziehen Sie Tor C, um lebende Zellen zu erhalten. Klicken Sie für das vierte zweidimensionale Diagramm auf die X-Achse, um Hoechst Rot auszuwählen, und klicken Sie auf die Y-Achse, um Hoechst Blau auszuwählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm und wählen Sie Eigenschaft aus dem Dropdown-Menü.
Wählen Sie das lineare Format sowohl für die x-Achse als auch für die y-Achse aus, und zeichnen Sie das Tor für die seitlichen Populationszellen. Verwenden Sie die 355-Nanometer- und 405-Nanometer-Laser gleichzeitig, um sowohl die Kontrollzellen als auch die Versuchszellen zu detektieren. Erfassen Sie Fluoreszenzsignale an den Kanälen von 690 x 50 und 450 x 50 Nanometern, die den beiden Lasern entsprechen.
Beobachten Sie die effektive Stimulation des Farbstoffs Hoechst 33342 mit 355- und 405-Nanometer-Lasern, um die Populationszellen der klaren Seite sichtbar zu machen. Verwenden Sie für die gleichen Proben die 375-Nanometer- und 405-Nanometer-Laser für die Zelldetektion. Der 355-Nanometer-Laser regte den Farbstoff Hoechst 33342 effektiv an, was zu einer klaren Beobachtung von SP-Zellen des Knochenmarks führte.
Es stellte sich heraus, dass die SP-Zellen der gleichen Proben, die mit dem 355-Nanometer-Laser und dem 405-Nanometer-Laser detektiert wurden, im Wesentlichen identisch sind. Sowohl 375-Nanometer- als auch 405-Nanometer-Laser regten Hoechst 33342 effektiv an, um SP-Zellen zu erhalten.
