Zu Beginn erhalten Sie HEK 293T-Zellen und eine Platte von 800.000 Zellen pro Well in einer 6-Well-Gewebekulturplatte in supplementierten DMEM-Medien. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, um eine Konfluenz von 60 bis 80 % zu erreichen. Mischen Sie anschließend ein Mikrogramm jeder Plasmid-DNA mit 200 Mikrolitern serumfreiem DMEM und sechs Mikrolitern Transfektionsreagenz.
Geben Sie nach 15 Minuten Inkubation 100 Mikroliter Transfektionsmischung pro Vertiefung der Zellen ab. Inkubieren Sie über Nacht in einem Inkubator mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Geben Sie am dritten Tag eine angemessene Menge Rapamycin oder Ethanol separat in die Zellen und inkubieren Sie sie eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.
Stellen Sie dann die Platte auf Eis und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit drei Millilitern kaltem PBS. Nach dem Entfernen des PBS fügen Sie 300 Mikroliter Lysepuffer hinzu, der entweder Rapamycin oder Ethanol enthält, und kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber ab. Füllen Sie die Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 1.000 g bei vier Grad Celsius.
Um die Expressionsniveaus zu überprüfen, aliquotieren Sie 20 Mikroliter des Überstands in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Inkubieren Sie die Probe mit 20 Mikrolitern 2x Laemmli-Puffer mit 5%Beta-Mercaptoethanol bei 95 bis 100 Grad Celsius für fünf Minuten.
