Zu Beginn werden die HEK 293 T-Zellen, die RapR-Shp2 exprimieren, für die Immunpräzipitation kultiviert und vorbereitet. Zur Zubereitung der Sepharose resuspendiertes Protein G-Sepharose in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen geben. Nach Zugabe des Lysepuffers das Röhrchen eine Minute lang bei 2000 G mikrozentrifugieren und den Lysepuffer vorsichtig entfernen.
Dann resuspendieren Sie die Sepharose in 380 Mikrolitern Lysepuffer, indem Sie das Röhrchen einige Male umdrehen. Inkubieren Sie die Sepharose mit BSA und den Antikörper auf einem Rotator bei vier Grad Celsius für 1,5 Stunden. Nachdem Sie die Sepharose, wie bereits gezeigt, gewaschen haben, verwenden Sie eine abgeschnittene Spitze, um sie vorsichtig im Lysepuffer zu resuspendieren.
Geben Sie den Überstand aus den präparierten HEK 293 T-Zellen, die RapR-Shp2 exprimieren, zu 50 Mikrolitern der suspendierten Sepharose in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie das Röhrchen auf einem Rotator bei vier Grad Celsius für 1,5 bis zwei Stunden.
