Zu Beginn erhalten Sie die HEK293T Zellen, die RapR-Shp2 exprimieren, und führen Sie eine Immunpräzipitation mit Protein G-Sepharose durch. Nach der Immunpräzipitation waschen Sie die Sepharose zweimal mit je 0,5 Millilitern Lysepuffer, gefolgt von 0,5 Millilitern Waschpuffer. Entfernen Sie nach dem letzten Schleudern so viel Puffer wie möglich.
Geben Sie dann 40 Mikroliter des Phospho-Paxillins in Imidazol-Puffermischung zu jeder Probe mit oder ohne ein mikromolares Rapamycin. Schnippen Sie vorsichtig über die Tube und legen Sie sie sofort für 40 Minuten bei 32 Grad Celsius in den Heizschüttler. Stellen Sie den Heizschüttler auf 1000 Umdrehungen pro Minute ein, um eine vollständige Bewegung der Probe zu gewährleisten.
Um die Reaktion zu stoppen, geben Sie 40 Mikroliter 2X Laemmli Puffer zu jeder Probe und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 95 bis 100 Grad Celsius. Nachdem die Proben abgekühlt sind, laden Sie 15 Mikroliter jeder Probe auf ein SDS-Polyacrylamidgel mit einer Steigung von vier bis 15 %. Führen Sie ein Standard-Western-Blot-Protokoll mit PVDF-Membranen aus.
Schließlich wird ein Blot mit einem Anti-FLAG-Antikörper zum Nachweis des RapR-Shp2-Konstrukts und einem Anti-Phospho-Paxillin zum Nachweis von phosphoryliertem Paxillin in den Proben durchgeführt. Aktives RapR-Shp2 zeigte kein Phospho-Paxillin, ähnlich wie das konstitutiv aktive Shp2, was auf eine Beibehaltung der vollen Aktivität hinweist. Inaktives RapR-Shp2 und dominantes negatives Shp2 zeigten ähnliche Phospho-Paxillin-Spiegel, was auf keine Aktivität bei Inaktivität hindeutet.
