Zu Beginn ordnen Sie den frisch vorbereiteten Filter sterilisiert Blockierungspuffer, 10X Reaktionspuffer eins und zwei auf einer Arbeitsplattform an. Offene Röhrchen mit 2,5 Millilitern Sperrpuffer und fünf Millilitern Reinstwasser in einen Exsikkator geben und unter Vakuum entgasen. Lassen Sie nach 15 Minuten den Druck ab und entfernen Sie die Schläuche.
Legen Sie die vorbereitete Biotin-PEG-Durchflusszellenbaugruppe auf einen Mikroskoptisch und befestigen Sie sie an jedem Ende mit Klebekitt. Verbinden Sie den Auslassschlauch der Durchflusszelle über eine Nadel mit der Spritzenpumpe. Schalten Sie die Objektivheizung auf 30 Grad Celsius ein.
Befestigen Sie ein bis zwei Milliliter entgastes Wasser in einem Rohr an einem separaten Stück Klebespachtel in der Nähe der Durchflusszelle. Führen Sie den Zulaufschlauch bis zum Boden in den Schlauch ein und lassen Sie Wasser durch den Kanal fließen. Erhöhen Sie die Durchflussrate, um eingeschlossene Blasen in der Nähe des Einlassschlauchs zu entfernen.
100 Mikroliter entgaster Blockierungspuffer werden zu einem 20-Mikroliter-Aliquot von einem Milligramm pro Milliliter Streptavidin gegeben. Befestigen Sie das offene Rohr an Klebekitt. Übertragen Sie den Einlassschlauch aus dem Wasser auf das Streptavidin und starten Sie den Durchfluss zwei Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 40 Mikrolitern pro Minute.
Nach fünf Minuten waschen Sie überschüssiges Streptavidin mit dem Blockierungspuffer aus. Fluss in biotinylierter DNA, verdünnt in einem Blockpuffer, der 25 nanomolare SYTOX Orange enthält. Bild mit Live-View mit dem 532-Nanometer-Laser, um die DNA-Bindung an die Oberfläche in Echtzeit zu beobachten.
Sobald die gewünschte DNA-Dichte auf der Oberfläche erreicht ist, wird ein Blockierungspuffer mit 25 nanomolaren SYTOX eingegossen, um die freie DNA auszuwaschen. Nun fließen und biotinylierter Anti-Digoxigenin-Antikörper in einem Blockierungspuffer verdünnt werden, der 25 nanomolare SYTOX Orange enthält. Waschen Sie den biotinylierten Anti-Digoxigenin-Antikörper und SYTOX Orange mit Blockierungspuffer aus.
Lassen Sie 50 Mikroliter ATP-gamma-S in die Durchflusszelle mischen. Geben Sie die gereinigte CMG-Helikase zu etwa 100 nanomolaren Endkonzentrationen in 30 Mikrolitern ATP-gamma-S-Mischung hinzu und fließen Sie bei 20 Mikrolitern pro Minute für 20 Mikroliter. 15 Minuten inkubieren.
Als nächstes fließen Sie die ATP-RPA-Mischung mit 40 Mikrolitern pro Minute für 80 Mikroliter ein. Visualisieren und erfassen Sie mit jedem Laser mit einer Belichtungszeit von 50 bis 100 Millisekunden EGFP RPA mit einem 488-Nanometer-Laser und dann CMG mit einem 640-Nanometer-Laser. Visualisieren und erfassen Sie schließlich SYTOX Orange-gefärbte DNA mit einem 532-Nanometer-Laser.
Die CMG-Helikase-Abwicklung der DNA wurde durch das lineare Wachstum der gelben RPA visualisiert, das im Laufe der Zeit verfolgt wurde und auf die abgewickelten DNA-Stränge hinweist. Einzelsträngige DNA-Schäden reduzierten die Anzahl der beobachteten erfolgreichen Abwicklungsereignisse, wie weniger vollständige Spuren in den Daten zeigen.
