Bereiten Sie zunächst den Master-Puffer vor. Filtern Sie ihn mit einem 0,22-Mikrometer-Filter mit Porengröße und lagern Sie den Puffer bei 4 Grad Celsius. Bereiten Sie als Nächstes 75 Milliliter Extraktionspuffer vor, indem Sie den Master-Puffer mit drei EDTA-freien Proteasehemmer-Tabletten, 2 Millimolar ATP und 0,1 Millimolar DTT ergänzen.
Geben Sie dann 75 Milliliter Extraktionspuffer zu dem Myosin-VIIA-exprimierenden gefrorenen Bakterienzellpellet und lassen Sie das Pellet im Extraktionspuffer auf Eis, bis es auftaut. Verwenden Sie danach eine serologische Pipette, um das Pellet aufzubrechen, um den Auftauprozess zu beschleunigen. Beschallen Sie nun die Resuspension auf Eis für 10 Minuten bei 50% Amplitude mit einer halben Zollspitze mit 5 Sekunden an und 5 Sekunden aus.
Das Gesamtlysat wird bei 33.746 g 30 Minuten lang bei 4 Grad Celsius zentrifugiert. Während der Zentrifugation werden 3 Milliliter der 50%igen Aufschlämmung des Anti-FLAG-Affinitätsharzes mit 40 Millilitern PBS gewaschen, um 1,5 Milliliter FLAG-Harz herzustellen. Anschließend zentrifugieren Sie das Harz bei 800 g für 2 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Entfernen Sie das PBS vorsichtig, ohne das Harz zu stören. Geben Sie dann den Überstand aus der Lysatzentrifugation zum gewaschenen Harz und inkubieren Sie mit kontinuierlicher Rotation bei 4 Grad Celsius für 1 Stunde. Pelletieren Sie das Harz, indem Sie es 2 Minuten lang bei 800 g bei 4 Grad Celsius zentrifugieren.
Und entfernen Sie den Überstand, ohne das Harz zu stören. Anschließend das Harz in 40 Millilitern Masterpuffer erneut suspendieren und 2 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 800 g zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Harz zu stören.
Übertragen Sie nun das gewaschene Harz auf zwei Polypropylen-Schleudersäulen. Waschen Sie jede Säule einmal mit 2 Millilitern Master-Puffer. Zentrifugieren Sie dann die Säule bei 1.400 G für 2 Minuten bei 4 Grad Celsius, um den Master-Puffer zu entfernen.
Um einen Elutionspuffer herzustellen, fügen Sie dem Master-Puffer 100 Mikrogramm pro Milliliter FLAG-Peptid hinzu. Fügen Sie dem gepackten Harz in jeder Säule 300 Mikroliter Elutionspuffer hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren, um sicherzustellen, dass das Harz vollständig durch den Elutionspuffer hydratisiert wird.
Dann zentrifugieren Sie die Säulen bei 1.400 G für 2 Minuten bei 4 Grad Celsius. Übertragen Sie den Durchfluss in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie es auf Eis. Führen Sie nun SDS-PAGE mit den Elutionsfraktionen durch, um ihre relativen Konzentrationen zu bestimmen.
Während das Gel läuft, bereiten Sie einen Dialysepuffer mit der angegebenen Zusammensetzung vor. Kombinieren Sie dann die konzentriertesten Fraktionen. Übertragen Sie die Probe in eine Dialysekassette mit einem Cutoff-Verhältnis von 10.000 Molekularen und dialysieren Sie sie über Nacht bei 4 Grad Celsius.
Entladen Sie die Probe am nächsten Tag vorsichtig aus der Dialysekassette. Aliquotieren Sie 15 Mikroliter pro PCR-Röhrchen und geben Sie die Röhrchen zum Schockfrosten in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff. Der gereinigte Myosin-VIIA-Komplex wurde durch SDS-PAGE bestätigt und zeigte eine Bande oberhalb des 200-Kilo-Dalton-Markers, die der Myosin-VIIA-Schwerkette entspricht, und drei unterschiedliche Banden zwischen den 22- und 14-Kilo-Dalton-Markern, die RLC-Calmodulin und Calmodulin-ähnliches Protein 4 repräsentieren.
