Geben Sie zunächst ein Kammervolumen des gereinigten humanen Myosin-7a-Proteins in 500 Millimolare Natriumchlorid-Motilitätspuffer in die Durchflusskammer und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Durchflusskammer mit drei Kammervolumina von einem Milligramm pro Milliliter BSA in 150 Millimolar Natriumchlorid-Motilitätspuffer. Ziehen Sie danach die Flüssigkeit mit einem sauberen Tuch am Auslass ab, um überschüssige Flüssigkeit aufzusaugen.
Fließen Sie dann ein Kammervolumen von 10 nanomolaren Rhodamin-Phalloidin-markierten F-Aktin in 150 Millimolar Natriumchlorid-Motilitätspuffer durch die Durchflusskammer. Überwachen Sie die Bindung von Aktinfilamenten an die Oberfläche unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 100-fachen Objektiv. Stellen Sie eine optimale Aktinfilamentdichte für die Verfolgung sicher, mit genügend Filamenten im Sichtfeld, aber spärlich genug, um Überlappungen zu vermeiden.
Waschen Sie anschließend die Durchflusskammer mit drei Kammervolumina mit 150 millimolaren Natriumchlorid-Motilitätspuffern, um ungebundene Aktinfilamente und überschüssiges Rhodamin-Phalloidin zu entfernen. Um die Motilität zu initiieren, geben Sie ein Kammervolumen des letzten Puffers in die Durchflusskammer. Nehmen Sie dann Bilder auf einem Fluoreszenzmikroskop mit 561-Nanometer-Anregung auf, um Rhodamin-Phalloidin-markiertes Aktin sichtbar zu machen.
Suchen Sie einen Bereich auf der Folie mit der gewünschten Aktindichte und nehmen Sie 30 Minuten lang alle 30 Sekunden Bilder auf. Laden Sie als Nächstes das Fast-Programm aus dem GitHub-Repository herunter und installieren Sie es. Stellen Sie sicher, dass es sich um die Python 3-kompatible Version mit einem zusätzlichen Modul für die ND2-Dateikonvertierung handelt.
Führen Sie das Schnellprogramm mit einem Toleranzwert von 33 aus, um nur sich gleichmäßig bewegende Filamente beizubehalten. Verwenden Sie anschließend das Schnell-Programm, um die neu erstellten TIFF-Bilder zu analysieren. Legen Sie den x-Maximalwert auf 20.000 Nanometer und den y-Maximalwert auf 20 Nanometer pro Sekunde fest, um die längste Filamentlänge und maximale Filamentgeschwindigkeit darzustellen.
Verwenden Sie dann px, um die Pixelgröße des erfassten Bildes auf 65 Nanometer festzulegen. Legen Sie minV auf 0,1 Nanometer pro Sekunde als Mindestgeschwindigkeit fest, die für die Einbeziehung des Filaments in die Analyse erforderlich ist. Um den maximal zulässigen Abstand zwischen Frames für zu verknüpfende Filamente festzulegen, verwenden Sie maxD, um das Verknüpfen separater Filamente zwischen Frames zu vermeiden.
Verwenden Sie pt, um die Toleranz für Schwankungen der Filamentgeschwindigkeiten festzulegen, wobei nur die Filamente mit gleichmäßigen Bewegungen berücksichtigt werden. Verwenden Sie abschließend d, um den Ordner anzugeben, der die TIFF-Stacks für die Analyse enthält. Der Aktin-Filament-Gleittest-Assay zeigte die langsame Beweglichkeit von Myosin-7a, wobei die Videowiedergabe um das 500-fache beschleunigt wurde, um die Bewegung sichtbar zu machen.
Die Geschwindigkeitsverteilung von Myosin-7a zeigte einen Peak von unter fünf Nanometern pro Sekunde, was seine langsame Motilität bestätigt.
