Waschen Sie zu Beginn zertifizierte Pinus pinaster-Samen in fließendem Leitungswasser, um größere Ablagerungen zu entfernen. Waschen Sie dann die feineren Ablagerungen mit einer handelsüblichen Waschmittellösung unter kräftigem Rühren. In einer Fließhaube eine handelsübliche Bleichlösung hinzufügen, bis die Samen bedeckt sind, und 15 Minuten lang kräftig mischen.
Nachdem Sie die Bleichlösung entsorgt haben, spülen Sie die Samen dreimal mit sterilisiertem Leitungswasser ab. Tauchen Sie nun die Samen 15 Minuten lang unter kräftigem Rühren in 80%iges Ethanol. Waschen Sie die Samen nach der Entsorgung von Ethanol dreimal mit sterilisiertem Reinstwasser.
Für die Keimung der Kiefer brechen Sie die sterilisierten Samenschalen mit einer sterilen mechanischen Drehmaschine. Isolieren Sie die Pinienkerne und legen Sie sie in einen geschlossenen Behälter mit sterilisiertem Nassfilterpapier, um sie über Nacht zu hydratisieren. Am nächsten Tag schichtest Du hydratisierte Pinienkerne sieben Tage lang bei vier Grad Celsius, um die Ruhephase zu unterbrechen und die Keimung zu synchronisieren.
Dann die Pinienkerne bis zur Keimung im Dunkeln bei 25 Grad Celsius halten. Setzen Sie die aseptisch gekeimten Kiefern für zwei Wochen oder bis zur Entwicklung des Hauptstamms in kontrollierte Umgebungsbedingungen um. Schneiden Sie nach zwei Wochen den oberirdischen Teil des Sämlings oberhalb der Wurzel mit einem Skalpell ab und geben Sie ihn in ein sterilisiertes Schenk Hildebrandt-Kultursubstrat.
Bewahren Sie die Kultur wie zuvor beschrieben unter kontrollierten Umgebungsbedingungen auf. Subkultur in regelmäßigen Abständen, indem das schwielige Gewebe an der Basis des Sprosses mit einem sterilen Skalpell abgeschnitten wird. Übertragen Sie den Sprosscluster mit einer sterilen Pinzette auf ein frisches Vermehrungskulturmedium.
Als nächstes inokulieren Sie die Mikrosprossen in das Schenk Hildebrandt-Nährmedium, das drei Gramm Aktivkohle pro Liter enthält, um die Mikrostielverlängerung zu gewährleisten. Legen Sie nun die länglichen Triebe ohne Phytohormone oder Aktivkohle in das Schenk Hildebrandt Kultursubstrat. Fügen Sie 100 bis 150 sterilisierte Kiefernnematoden im gemischten Lebensstadium am Boden des Mikrosprosses hinzu.
Bewahren Sie die Kultur wie zuvor beschrieben unter kontrollierten Umgebungsbedingungen auf. Die Etablierung und Infektion von in-vitro-Kieferntrieben zeigte das Auftreten von chlorotischen Nadeln innerhalb eines Monats nach der Co-Kultur mit Kiefernholznematoden.
