Kultivieren Sie zunächst das gehackte Kleinhirngewebe, das von einem 10 Tage alten Mausjungen-Adler in einem basalen Medium entnommen wurde. Geben Sie DNA-schädigende Chemikalien in geeigneten Endkonzentrationen direkt in das Kulturmedium. Nach der Expositionszeit wird das Medium durch ein frisch zubereitetes Mischmedium ersetzt, das die DNA-schädigenden Chemikalien und den Poly-ADP-Ribose-Glykohydrolase-Inhibitor enthält, und 30 Minuten lang inkubieren.
Nach 30 Minuten die Scheiben mit 0,1 molaren Phosphatpuffer bei Raumtemperatur waschen und sofort mit einem vorgekühlten Aceton-Methanol-Gemisch fixieren. Inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius. Entfernen Sie dann die Fixierlösung und waschen Sie sie mit 0,4 molaren Phosphatpuffer.
Geben Sie 100 Mikroliter 0,1 molaren Phosphatpuffer in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte. Entfernen Sie dann mit einem Skalpell und einem Schneidebrett die Ränder des Einsatzes und schneiden Sie um die Gewebescheibe herum. Legen Sie die Scheibe in eine Vertiefung der 48-Well-Platte.
Nach dem Aspirieren des Puffers wird der Einsatz mit 100 Mikrolitern 0,1 molaren Phosphatpuffer mit 1 % Triton X100 inkubiert. Aspirieren Sie die Lösung und inkubieren Sie das Insert in jeder Vertiefung seriell auf einem Schüttler mit entsprechenden Mengen der Blockierungslösung, gefolgt von der Primärlösung in den Sekundärantikörpern. Geben Sie 20 Mikroliter der endgültigen DAPI-Lösung 20 Minuten vor Ende der zweistündigen Inkubation mit dem Sekundärantikörper in jede Vertiefung und schütteln Sie 20 Minuten lang weiter.
Legen Sie das Gewebe zur Montage mit dem Gewebe nach oben auf einen Objektträger aus Mikroskopglas. Fügen Sie das Eindeckmedium hinzu und decken Sie es mit einem Deckglas ab. Legen Sie die Objektträger auf eine ebene Fläche und lassen Sie sie über Nacht im Dunkeln bei vier Grad Celsius trocknen.
Die Kleinhirnfoliation wurde in der Kultur beibehalten. Purkinje-Zellen wurden für Calbindin D-28K und neurale Kerne für NeuN angefärbt. Die Astrozyten in den Purkinje-Zellen wurden auf GFAP gefärbt.
Die PAR-Färbung nahm in behandelten Purkinje-Zellen nach Exposition gegenüber Kaliumbromat und Paraquat zu, was auf DNA-Schäden hinweist.
