Um Mitochondrien zu isolieren, legen Sie die betäubte enthauptete Ratte in Bauchlage auf Eis. Nachdem Sie das Herz freigelegt haben, schneiden Sie die Aorta etwa vier bis sechs Millimeter oberhalb der Aortenwurzel und unterhalb der Verzweigungspunkte der Halsschlagader. Kanülieren Sie die Aorta und perfundieren Sie das Herz mit eiskalter Kardioplegielösung mit einem schwerkraftabhängigen Druckkopf, bis die Koronararterien vom Blut befreit sind und das Organ blanchiert erscheint.
Präparieren Sie die Vorhöfe, das knorpelige Klappengewebe und das Fettgewebe, um das ventrikuläre Myokard zu isolieren. Hacken Sie das Gewebe mit einer scharfen chirurgischen Schere, bis die Stücke etwa einen Kubikmillimeter groß sind. Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in das vorgekühlte Zentrifugenröhrchen, das mit den Spins eins und zwei gekennzeichnet ist und die Proteaselösung enthält.
Geben Sie eiskalten Isolationspuffer bis zu einem Endvolumen von 25 Millilitern. Dispergieren Sie das Gewebe mit einem motorisierten Stator-Homogenisator mit einem motorisierten Handrotor 20 bis 25 Sekunden lang bei 18.000 U/min auf Eis. Zentrifugieren Sie das homogenisierte Gewebe bei 8.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand. Spülen Sie das Pellet vorsichtig mit fünf Millilitern Isolationspuffer aus, um verbleibende Protease zu entfernen. Nachdem Sie die Spülung verworfen haben, fügen Sie eiskalten Isolationspuffer bis zu einem Endvolumen von 25 Millilitern hinzu.
Dann vortexen, um das Pellet wieder aufzuwirbeln. Zentrifugieren Sie das Gewebehomogenat bei 800 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Gießen Sie den Überstand mit den Mitochondrien vorsichtig in ein beschriftetes, vorgekühltes 50-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie nun den Überstand bei 8.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und behalten Sie die Mitochondrien, die das Pellet enthalten. Nehmen Sie mit einem fusselfreien Tuch überschüssigen Überstand von der Innenwand des Rohrs auf, ohne das Pellet zu stören, und legen Sie das Rohr auf Eis.
Geben Sie 80 Mikroliter eiskalten Isolationspuffer auf den Boden des Röhrchens und setzen Sie die Mitochondrien vorsichtig mit einer Mikropipette wieder auf. Nach der Resuspendierung werden die Mitochondrien in ein vorgekühltes, markiertes Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Bestimmen Sie die mitochondriale Proteinkonzentration mit dem Bison-Kinetsäure-Protein-Assay.
In einem vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen wird der mitochondriale Stamm mit einem Isolationspuffer auf die gewünschte Arbeitskonzentration verdünnt. Um die Lebensfähigkeit und Qualität von mitochondrialen Isolaten zu testen, laden Sie 2,3 Milliliter Atmungspuffer in die Oxygraph-Kammern. Lassen Sie das Sauerstoffverbrauchssignal etwa 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius ausgleichen oder bis die Rate nahe Null liegt.
Nach der Äquilibrierung werden die Stopfen nach unten gedrückt und der überschüssige Puffer abgesaugt. Fügen Sie mit einer 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze ein millimolares EGTA hinzu, um das restliche Kalzium im Atmungspuffer auf dem Oxygraphen zu chelatisieren. Um die Atmung anzukurbeln, fügen Sie dem Puffer fünf Millimolare Natriumpyruvat und ein Millimolar Al-Malat hinzu.
Fügen Sie dann einen Bolus aus verdünnten Mitochondrien hinzu und lassen Sie die Atmung fünf Minuten lang erfolgen. Fügen Sie nach fünf Minuten einen Bolus von 500 mikromolaren ADP hinzu, um die Atmung im dritten Zustand zu initiieren. Um das Atemkontrollverhältnis zu berechnen, dividieren Sie die maximale Rate des Sauerstoffverbrauchs während des dritten Zustands durch die Rate des Sauerstoffverbrauchs kurz vor der Zugabe von ADP in Zustand zwei.
Unmittelbar nach der ADP-Zugabe wurde ein rascher Anstieg des Sauerstoffverbrauchs beobachtet, was auf eine erfolgreiche Initiierung der oxidativen Phosphorylierung in isolierten kardialen Mitochondrien hinweist. Herzmitochondrien von Meerschweinchen, Sprague-Dawley-Ratten und Friend-Leukämievirus-B-Mäusen zeigten hohe respiratorische Kontrollverhältnisse, was auf eine gute mitochondriale Isolationsqualität hinweist. Leber- und Nierenmitochondrien von Sprague-Dawley-Ratten wiesen ebenfalls akzeptable Atemkontrollverhältnisse auf, die eine erfolgreiche Isolierung unterstützen.
HEK293-Zellen wiesen Werte des respiratorischen Kontrollverhältnisses über dem akzeptablen Schwellenwert auf, was die Qualität der mitochondrialen Isolierung aus diesen Zellen bestätigt.
