Nehmen Sie zunächst kultivierte U2OS-Zellen mit einer Konfluenz von 60 % bis 70 % und spalten Sie sie mit 0,25 % Trypsin-EDTA. Bereiten Sie 60-Millimeter-Platten vor, indem Sie runde 13-Millimeter-Deckgläser hinzufügen. Platte 400.000 Zellen in einer 60-Millimeter-Platte, die mehrere 13 Millimeter runde Deckgläser enthält.
Entfernen Sie dann das Nährmedium von den Platten. Geben Sie Kulturmedium mit 25 mikromolaren Etoposid hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 20 Minuten, 1 Stunde und 3 Stunden. Nach der Inkubation das Medium von den Platten nehmen.
Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie eiskaltes Methanol in ausreichendem Volumen hinzu, um die Deckglasoberfläche zu bedecken, und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Waschen Sie dann die Deckgläser dreimal mit PBS und geben Sie sie in eine Feuchtigkeitskammer.
Nach dem Abklopfen von PBS 30 bis 40 Mikroliter Permeabilisierungspuffer hinzufügen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie danach die Einbezugsbezüge dreimal mit PBS. Tippen Sie dann die PBS aus den Samples ab.
Geben Sie 30 bis 40 Mikroliter der im PLA-Kit enthaltenen Blockierungslösung zu jedem Deckglas. Inkubieren Sie die Platte in einer vorgeheizten Feuchtigkeitskammer bei 37 Grad Celsius für 1 Stunde. Verdünnen Sie nun die Primärantikörper in dem im Kit enthaltenen Antikörperverdünnungsmittel.
Nach dem Abklopfen der Blockierungslösung die primäre Antikörperlösung auf jedes Deckglas geben und über Nacht bei vier Grad Celsius in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren. Verdünnen Sie die Minus- und Plussonden eins bis fünf im Antikörperverdünnungsmittel. Verwenden Sie Kombinationen wie Esel Anti-Maus MINUS mit Esel Anti-Ziege PLUS und Esel Anti-Maus MINUS mit Esel Anti-Kaninchen PLUS.
Nun klopfen Sie die primäre Antikörperlösung ab und waschen Sie sie einmal mit TBST. Nachdem Sie den überschüssigen TBST abgeklopft haben, geben Sie 20 Mikroliter der PLA-Sondenlösung auf die Deckgläser. Dann in der vorgeheizten Feuchtigkeitskammer bei 37 Grad Celsius 1 Stunde lang inkubieren.
Verdünnen Sie den 5x Ligationspuffer in hochreinem Wasser. Klopfen Sie die PLA-Sondenlösung ab und waschen Sie sie einmal mit TBST. Geben Sie nun Ligase in einer Verdünnung von 1:40 in die Ligationslösung, bevor Sie sie auf die Proben auftragen.
In der vorgeheizten Feuchtigkeitskammer bei 37 Grad Celsius 30 Minuten inkubieren. Als nächstes verdünnen Sie den 5x Amplifikationspuffer in hochreinem Wasser. Sobald die Ligationslösung aus den Proben entfernt wurde, waschen Sie die Proben einmal mit TBST.
Geben Sie die Polymerase unmittelbar vor dem Auftragen auf die Proben in Verdünnungen von 1:80 in die Amplifikationslösung. In der vorgeheizten Feuchtigkeitskammer bei 37 Grad Celsius 100 Minuten inkubieren. Klopfen Sie den Amplifikationspuffer ab und waschen Sie ihn dann zweimal 10 Minuten lang mit SSC-Puffer.
Nachdem Sie die Proben zweimal mit PBS gewaschen haben, geben Sie die primäre Antikörperlösung auf jeden Deckglas und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation klopfen Sie die primäre Antikörperlösung ab und waschen Sie sie dreimal mit TBST. Geben Sie dann die Sekundärantikörperlösung auf jedes Deckglas und inkubieren Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Danach fünfmal mit TBST, zweimal mit SSC-Puffer und zweimal mit 0,01x SSC-Puffer waschen. Erfassen Sie schließlich Bilder aus verschiedenen Vertiefungen oder Deckgläsern, um Artefakte aufgrund inhomogener Inkubation zu vermeiden, und speichern Sie alle Kanäle mit demselben Namensmuster.
