Öffnen Sie nach der Durchführung der PLA-Punkterfassung zur Lokalisierung der Proteininteraktion Bilder unter verschiedenen Bedingungen, um die Parameter für die Analyse in ImageJ anzupassen. Ermitteln und spezifizieren Sie diese Parameter zusammen mit den Daten im Makroprogramm. Um den Hintergrund zu entfernen, klicken Sie auf "Verarbeiten und Hintergrund subtrahieren".
Nutzen Sie die Vorschaufunktion, um verschiedene Rollkugelradien zu testen. Um Rauschen zu entfernen, klicken Sie auf Prozess, Rauschen und Flecken entfernen. Klicken Sie dann im Nukleus-Menü auf Verarbeiten und glätten, um die Glättungsfunktion anzuwenden und die Füllung zu verbessern.
Klicken Sie nun auf Bild, dann auf Typ und wählen Sie 8-Bit, um es in ein 8-Bit-Bild zu konvertieren. Passen Sie danach den Schwellenwert an, indem Sie zu Bild, Anpassen und schließlich zu Schwellenwert gehen. Passen Sie den Schwellenwert an, um alle Kerne oder Punkte im Bild zu visualisieren und gleichzeitig eine Übersättigung und das Zusammenfallen von Strukturen zu vermeiden.
Notieren Sie sich auch die Werte und testen Sie in verschiedenen Bildern. Um in eine Maske zu konvertieren, klicken Sie auf "Verarbeiten", "Binär" und "In Maske konvertieren". Klicken Sie für den Kern auf Prozess, Binär und Löcher füllen, gefolgt von Prozess, Binär und Wasserscheide.
Klicken Sie für die PLA-Punkte auf Process, Binär und Watershed. Um Kerne zu zählen, messen Sie die Fläche oder Länge der verschiedenen Kerne, um die durchschnittliche Größe zu schätzen. Verwenden Sie einen ungefähren Wert, um Partikel zu analysieren, indem Sie auf Analysieren und Partikel analysieren klicken.
Stellen Sie die Größe auf 15 unendlich ein und überprüfen Sie die Optionen. Maske anzeigen, Ergebnisse anzeigen, Ergebnisse löschen, zum Manager hinzufügen und an Kanten ausschließen. Um PLA-Punkte zu zählen, messen Sie ihre Fläche oder ihren Radius, um ihre durchschnittliche Größe zu schätzen.
Klicken Sie für jeden ROI im ROI-Manager auf Analysieren und Partikel analysieren. Legen Sie die Größe auf 0,02 bis 3 fest. Aktivieren Sie die Optionen Maske anzeigen, Ergebnisse anzeigen, Ergebnisse löschen, Zusammenfassen und Ausschließen an Kanten.
Speichern Sie die Ergebnisse, die die Anzahl der Punkte pro Kern in jedem im Bild vorhandenen Kern anzeigen. Die Nek4 Ku70-Interaktion nahm im Zellkern nach DNA-Schäden nach 20 Minuten, einer Stunde und drei Stunden Etoposidbehandlung im Vergleich zu Kontroll- und DMSO-behandelten Zellen zu. Die Behandlung mit Etoposid erhöhte signifikant die Nek5-Topoisomerase-2-beta-Interaktion im Vergleich zur DMSO-Kontrolle.
Die Gamma-H2AX-Färbung nahm nach 20-minütiger Etoposidbehandlung zu und blieb bis zu drei Stunden lang erhöht, was auf eine anhaltende Reaktion auf DNA-Schäden hinweist.
