Um den kinetischen Assay für RBPR2- und STRA6-Peptide einzurichten, verdünnen Sie die RBPR2-, mutierten RBPR2- und STRA6-Peptide der Maus seriell in Laufpuffer. Öffnen Sie die Steuerungssoftware, und wählen Sie den Kinetic SOAR Affinity-Assistenten aus. Wählen Sie im Dialog für die Einspritzsequenz den Fließweg 2.1 mit der aktiven Strömungszelle 2 und der Strömungszelle 1 als Referenz aus.
Aktivieren Sie im Setup-Dialog die Option Startzyklen ausführen, geben Sie die Lösung als Puffer ein, geben Sie die Anzahl der Zyklen an und klicken Sie auf Weiter. Gehen Sie nun in den Dialog mit den Injektionsparametern und geben Sie Probenparameter wie die Kontaktzeit von 120 Sekunden, die Durchflussrate von 30 Mikrolitern pro Minute und die Dissoziationszeit von 300 Sekunden ein. Stellen Sie für die Regenerationsparameter die Regenerationslösung auf Glycinsalzsäure mit einer Kontaktzeit von 30 Sekunden und einer Durchflussrate von 30 Mikrolitern pro Minute ein und klicken Sie dann auf Weiter.
Geben Sie im Dialogfeld "Proben" die Namen, Molekulargewichte und Konzentrationen der Peptide ein und klicken Sie dann auf "Weiter". Ordnen Sie im Rack-Positionsdialog die verdünnten Peptide als einzelne 120-Mikroliter-Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen von einem bis 100 Mikromolar den dafür vorgesehenen Positionen auf dem Rack zu. Klicken Sie auf Auswurfgestell und setzen Sie alle Fläschchen ein.
Klicken Sie anschließend auf Weiter und dann im Dialogfeld Protokoll vorbereiten auf Start. Geben Sie einen Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern. Klicken Sie nun in der Software auf das Startmenü und wählen Sie eine Bewertung aus.
Öffnen Sie die Datei und wählen Sie dann aus dem Dropdown-Auswahlmenü FC-2.1, um das leere subtrahierte aktive Sensorgramm der Referenzzelle für die Assoziations- und Dissoziationsphasen der Peptide msRBP4, mutierte msRBPR2 und msSTRA6 zu analysieren. Klicken Sie anschließend auf die Dropdown-Schaltfläche Kinetik oder Affinität und wählen Sie Oberflächenbegrenzung aus. Aktivieren Sie im Dialogfeld "Kurven auswählen" die Option Spalte in der Tabelle einschließen, und klicken Sie auf "Weiter".
Gehen Sie nun zum Dialogfeld "Daten auswählen" und sehen Sie sich die leeren subtrahierten Sensorgramme an. Klicken Sie auf Kinetik und Affinität. Behalten Sie die Standardparameter bei, und klicken Sie auf Für Kurvenanpassung anpassen.
Überprüfen Sie die Registerkarte "Bericht" auf die Gleichgewichtsdissoziationskonstante Kd, die Assoziationsrate Ka oder Kon und die Dissoziationsrate Kd oder Koff. Speichern Sie das Kinetik-Datensensorgramm auf der Registerkarte "Text" in einem eingeschränkten Format und verwenden Sie die Werte, um Diagramme zu zeichnen.
