Zu Beginn enukleieren Sie die Augenkugeln der euthanasierten Maus und homogenisieren Sie die Augen in einem eiskalten Puffer. Das Homogenat wird bei 16.000 g 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand, der wasserlösliche Proteine und andere Verunreinigungen enthält.
Anschließend resuspendieren und lösen Sie die pelletierte Membran und die Membranproteine in einem Puffer für eine Stunde bei vier Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform auf. Anschließend zentrifugieren Sie die resolubilisierte Membranfraktion eine Stunde lang bei 16.000 G bei vier Grad Celsius. Mischen Sie den Überstand mit 30 bis 50 Mikrolitern Rho1D4-Antikörperkügelchen und leeren Immunglobulin-G-Antikörperkügelchen in zwei getrennten unabhängigen Proben und inkubieren Sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform.
Trennen Sie den Pull-Down mit einem Magnetständer, indem Sie die Perlen auffangen. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen mit einem Puffer mit hohem und niedrigem Salzgehalt, der Bis-Tris-Propan, Natriumchlorid und N-Dodecyl-beta-D-maltosid enthält. Um das Rhodopsin-Protein zu eluieren, inkubieren Sie die Kügelchen fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem 65-Mikroliter-Puffer der angegebenen Zusammensetzung.
Analysieren Sie dann mit einer rechteckigen Submikro-Quarzelle von 50 Mikrolitern mit einer Öffnung von zwei Millimetern und einer Weglänge von 10 Millimetern das Eluat auf Absorption von 200 Nanometern bis 800 Nanometern in einer schnellen Scan-Einstellung mit einem Spektralphotometer. Um die Qualität zu validieren und zu bestimmen, setzen Sie das Eluat eine Minute lang hellem Licht aus. Wiederholen Sie dann die Absorptionsmessung.
Subtrahieren Sie die Blindabsorption und berechnen Sie das Verhältnis der analysierten Absorptionsspektren. Plotten Sie dann die leeren subtrahierten Absorptionsspektren und berechnen Sie den freien Opsinwert. Berechnen Sie anschließend unter Verwendung des Beer-Lambert-Gesetzes die Konzentration von Rhodopsin, berechnen Sie dann die Konzentration von ligandenfreiem Opsin und schätzen Sie den Konzentrationsunterschied für Apo-Opsin und ligandenfreies Opsin in Menge und Prozentsatz.
