Sammeln Sie zunächst die gefrorenen, hitzegestressten und unbehandelten fünf Tage alten Columbia-0 Arabidopsis-Sämlinge in den Flüssigstickstoffbehälter. Mahlen Sie die Sämlinge mit einem Homogenisator eine Minute lang zu Pulver. Geben Sie dann 500 Mikroliter Polysomen-Extraktionspuffer in das Röhrchen.
Drehen Sie das Röhrchen um und wirbeln Sie es, um die Probe zu mischen. Zentrifugieren Sie die Extraktionslösung bei 12.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Filtrieren Sie dann den Überstand durch ein 100-Mikrometer-Zellensieb, um eine klare, partikelfreie Extraktionslösung zu erhalten.
Der gefilterte Überstand wird auf den vorbereiteten Saccharosegradienten geladen und gewartet, bis er das Gleichgewicht erreicht hat. Dann ultrazentrifugieren Sie den Gradienten mit einem schwingenden Schaufelrotor bei 210.000 G für 3,5 Stunden bei vier Grad Celsius mit maximaler Beschleunigungs- und Verzögerungsrate. Die nicht-polysomale und polysomale RNA werden anhand ihrer Dichte in der entsprechenden Saccharose-Gradientenlösung getrennt.
Bereiten Sie die Chase-Lösung für die Mikrovolumen-Spritzenpumpe vor, die aus 70 % Saccharose, 10 % Glycerin und 0,02 % Bromphenolblau besteht. Mischen Sie die Lösung 30 bis 40 Minuten lang gründlich. Nach dem Einspritzen der Begleitlösung in den Gradienten wird mit der Software der Dichtegradientenfraktionator gesteuert.
Kalibrieren Sie dann die Maschine mit entionisiertem Wasser. Nach der Ultrazentrifugation setzen Sie das Röhrchen auf den Dichtegradientenfraktionator. Verbinden Sie den Schlauch mit dem Schlauchdurchstechsystem mit der Spritzenpumpe und dem UV-Detektor.
Schalten Sie den Dichtegradientenfraktionator auf den Remote-Softwaresteuerungsmodus um. Stellen Sie die Injektionsdurchflussrate der Mikrovolumen-Spritzenpumpe auf drei Milliliter pro Minute ein. Starten Sie den Prozess zur Erstellung des Polysomenprofildiagramms, indem Sie die optische Dichte bei 254 Nanometern mit dem Fraktionator messen.
Basierend auf den Messungen des Polysomenprofils werden die nicht-polysomalen und polysomalen RNA-Fraktionen getrennt gesammelt. Mischen Sie die gesammelten RNA-Fraktionen gründlich mit vorkalter zweifacher Salzlösung. Fügen Sie dann acht Mikroliter einer verdünnten Brühe eukaryotischer poly-A-RNA-Kontrolle aus dem Kit hinzu.
Zentrifugieren Sie die mit hoher Salzlösung angereicherte RNA mit einem schwingenden Schaufelrotor fünf Stunden lang bei 450.000 g bei vier Grad Celsius. Gießen Sie den Überstand vorsichtig ab und waschen Sie das RNA-Pellet dreimal mit 500 Mikrolitern vorkaltem, DEPC-behandeltem Wasser. Geben Sie nach dem letzten Waschen 500 Mikroliter RNA-Extraktionsreagenz in die RNA-Probe.
Mischen und 10 Minuten inkubieren. 100 Mikroliter Chloroform zugeben und gründlich mischen. 10 Minuten inkubieren, um eine Phasentrennung zu ermöglichen.
Zentrifugieren Sie die Mischung bei 12.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Die obere durchsichtige wässrige Schicht, die RNA enthält, wird in ein neues Röhrchen überführt und vorsichtig mit dem gleichen Volumen Isopropanol gemischt. Inkubieren Sie das Gemisch zwei Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius, um die RNA auszufällen.
Nach der Fällung erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen, wobei das RNA-Kügelchen am Boden verbleibt. Waschen Sie das RNA-Pellet mit einem Milliliter vorkaltem 75%igem Ethanol. Zentrifugieren Sie bei 12.000 g 10 Minuten bei vier Grad Celsius und trocknen Sie das RNA-Pellet an der Luft.
Nach dem Trocknen resuspendieren Sie das Pellet in 30 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Vollspektrum-Spektralphotometer bei 220 bis 750 Nanometern, wobei der Schwerpunkt auf der optischen Dichte bei 260 Nanometern liegt. Das Polysomen-Profiling zeigte unter normalen Bedingungen eine deutliche Trennung zwischen der nicht-polysomalen und der polysomalen Fraktion.
Hitzestress bei 40 Grad Celsius reduzierte die Signalintensität der polysomalen Fraktion signifikant, und dieser Effekt kehrte sich nach einer zweistündigen Erholung bei 22 Grad Celsius um, wodurch das Signal wieder auf Kontrollniveau gebracht wurde. Die Ergebnisse der RNA-Extraktion deuteten darauf hin, dass Hitzestress den Anteil der RNA in der polysomalen Fraktion reduzierte, die nach der Erholung bei 22 Grad Celsius wiederhergestellt wurde.
