Sammeln Sie zunächst das Eierstockgewebe aus dem Operationssaal nach der Biopsie in einem Röhrchen, das fünf Milliliter ergänztes 1X DPBS enthält. Schneiden Sie mit einem sterilen Skalpell ein kleines Stück Eierstockgewebe von etwa zwei Millimetern Würfeln von der Oberfläche des Eierstocks ab. Tauchen Sie dann das Gewebe zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 350 Mikroliter Bouin-Lösung.
Waschen Sie das Gewebe nach der Inkubation dreimal mit 70% Ethanol. Führen Sie nach dem Einbetten und Schneiden des Gewebes eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung durch und erfassen Sie digitale Bilder für die Analyse. Öffnen Sie die Dateien mit der entsprechenden Software, z. B. QuPath.
Ziehen Sie die Datei in das Hauptfenster von QuPath und stellen Sie den Bildtyp auf Hellfeld H&E ein. Definieren Sie mit der Maßstabsleiste einen Millimeter vom Oberflächenepithel entfernt. Klicken Sie auf das Ellipsenwerkzeug und kommentieren Sie die Follikel.
Zählen Sie die Anzahl der Follikel innerhalb dieses Ein-Millimeter-Bereichs vom primordialen bis zum primären Reifungsstadium. Geben Sie die Proben-ID, das Alter, die Anzahl der Follikel für jeden Objektträger, die Abschnittsdicke und den gezählten N-Abschnitt in das Blatt Follikel in Millimeter cube in der Excel-Datei Follikel Z-Score Calculator ein. Nachdem Sie die größten 10 % der Follikel in jedem gezählten Abschnitt identifiziert haben, klicken Sie auf das Linienwerkzeug und zeichnen Sie zwei senkrechte Linien durch die Eizellmembran.
Wählen Sie Messen und klicken Sie dann auf Annotationsmessungen anzeigen, um den mittleren Durchmesser dieser Eizellen zu bestimmen. Notieren Sie die Messungen unter der Spalte mit der Bezeichnung Länge in Mikrometern. Geben Sie den mittleren Eizelldurchmesser der größten 10%-Follikel in Mikrometern für jeden Objektträger in die Excel-Datei des Follikel Z-Score Calculator ein.
Platzieren Sie das Bild in der Mitte des Bildschirms in QuPath und klicken Sie auf das ImageJ-Symbol. Wählen Sie dann Snapshot an ImageJ senden aus. Begrenzen Sie in ImageJ mit dem Pinselwerkzeug einen Millimeter vom Rand und klicken Sie auf Bild, dann auf Typ und wählen Sie 8-Bit.
Klicken Sie anschließend auf das Linienwerkzeug und zeichnen Sie eine Linie auf der Maßstabsleiste. Wählen Sie "Analysieren" und dann "Maßstab festlegen" aus, geben Sie die auf der Maßstabsleiste angegebene Länge in das Feld "Bekannte Entfernung" ein und klicken Sie auf "OK". Klicken Sie dann auf Bild, passen Sie Helligkeit/Kontrast an und wählen Sie Auto. Klicken Sie nun auf Bild, passen Sie den Schwellenwert an und wählen Sie Auto.
Klicken Sie auf das Zauberstab-Werkzeug, wählen Sie den Bereich aus und drücken Sie dann Strg M.Geben Sie den Flächenwert in die Excel-Datei Follicle Z-Score Calculator ein. Sobald alle Daten in der Excel-Datei des Follikel-Z-Score-Rechners tabellarisch erfasst sind, gehen Sie zu dem Blatt mit dem Namen Z-Score Follikel pro Millimeter-Würfel in derselben Excel-Datei, um festzustellen, ob die Eierstockreserve reduziert ist. Das Oberflächenepithel des Eierstocks eines Kindes war deutlich sichtbar, wobei sich die Eierstockreserve nach der Färbung darunter befand.
Zur Berechnung der Z-Werte der ovariellen Reserve wurde die Follikeldichte verwendet, wobei ein Z-Score von weniger als minus 1,7 auf eine verringerte ovarielle Reserve hinweist.
