Extrahieren Sie zunächst DNA aus dem Pflanzengewebe und bestimmen Sie die DNA-Konzentration. Richten Sie die Reaktion ein, nachdem Sie alle erforderlichen Komponenten in ein 0,2-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gegeben haben. Nach der Primeramplifikation laden Sie drei Mikroliter des PCR-Produkts und zwei Mikroliter eines DNA-Markers mit 5.000 Basenpaaren in die Vertiefungen eines Agarosegels.
Stellen Sie die Spannung auf 120 Volt und den Strom auf 400 Milliampere ein und lassen Sie die Elektrophorese 40 Minuten lang laufen. Verwenden Sie ein vielseitiges Gel-Bildanalysesystem, um die Gelergebnisse anzuzeigen und zu analysieren. Nachdem Sie das Beispiel durch eine Sequenziereinheit geführt haben, wählen Sie Neues Projekt erstellen und klicken Sie auf OK, um zur Startseite der Software zu gelangen.
Wählen Sie im Menü Datei die Option Importieren und Beispiele hinzufügen aus. Wählen Sie die Datei im Sequenz-Trace-Format aus, und importieren Sie sie als die Datei, die unter nicht assemblierten Proben verarbeitet werden soll. Wählen Sie Contig.
Gehen Sie dann zu Erweiterte Baugruppe, und wählen Sie In Gruppen einbauen aus. Wenn das Dialogfeld mit der Aufforderung zum Definieren von Namen angezeigt wird, ändern Sie den Dateinamen im Abschnitt zum Definieren von Beispielnamenteilen, und klicken Sie auf Einbauen, um die ausgerichtete Sequenz anzuzeigen. Wählen Sie Los und dann Suchsequenz aus, und klicken Sie auf OK, um die passende Sequenz zu finden.
Wählen Sie "Contig" und dann "Löschen" aus, um die 5,8S- und 28S-Regionen sowie alle Sequenzen mit geringer Qualität zu entfernen. Exportieren Sie die Ausgabe mit den gespleißten Sequenzen für den Abgleich. Wählen Sie eine BLAST-Suche mit der Nukleotiddatenbank am NCBI aus.
Wählen Sie das Speziesidentifizierungstool und den spezifischen Primer ITS-2, der der Globalen Pharmakopöe-Genomdatenbank entspricht. Laden Sie Sequenzen von drei Arten von Angelika und einer Art von Peucedanum praeruptorum als Außengruppe von NCBI herunter. Analysieren Sie diese Sequenzen zusammen mit den erhaltenen Ergebnissequenzen.
Klicken Sie dann auf Datei. Wählen Sie Datei öffnen oder Sitzung aus, um die Datei zu importieren, und ein Dialogfeld wird angezeigt. Wählen Sie Align gefolgt von DNA und dann Align by ClustalW für den Sequenzvergleich.
Navigieren Sie zu Phylogenie, und klicken Sie auf Test Neighbor Joining Tree konstruieren, um einen phylogenetischen Baum zu generieren. Die Ergebnisse der Gelelektrophorese zeigten einzelne klare Banden um 500 Basenpaare für die Proben AS1, AS2 und AS3, ohne Banden in der Negativkontrolle, was auf eine erfolgreiche Amplifikation der extrahierten DNA hinweist. Die Sequenzierungsergebnisse identifizierten Angelica sinensis mit einer 100%igen Sequenzähnlichkeit unter Verwendung von BLAST, was mit den Ergebnissen aus der GPGD-Datenbank übereinstimmte.
In der phylogenetischen Analyse gruppierten sich die Spleißsequenzen mit Angelica sinensis OR8797150.1 mit einem Bootstrap-Unterstützungswert von 100, was die Identifizierung als Angelica sinensis beweist.
