Legen Sie zunächst das extrahierte Mausgewebe in das Gewebemahlröhrchen, das 50 % eiskalte Kochsalzlösung und 50 % Methanol enthält. Führen Sie den Stößel in das Mahlrohr ein und drehen Sie ihn vorsichtig fünfmal, um das Gewebe zu homogenisieren. Übertragen Sie das homogenisierte Gewebe sofort in ein 15-Milliliter-Röhrchen.
Geben Sie zwei Milliliter Methanol und einen Milliliter 0,1 molare Hydroxylamine in die homogenisierte Probe. Lassen Sie die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur ziehen. Für die Retinoid-Extraktion fügen Sie dem Homogenat 10 Milliliter Hexan hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen mindestens 10 Sekunden lang horizontal durch.
Das Homogenat-Hexan-Gemisch wird drei Minuten lang bei 1000 x g zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Übertragen Sie die Hexanschicht mit einer Pipette in ein separates 15-Milliliter-Glasröhrchen und geben Sie die Probe in eine Vakuumzentrifuge, um das Hexan aus der extrahierten Probe vollständig zu verdampfen. Resuspendieren Sie die getrockneten Retinoide in der 15-Milliliter-Tube mit 100 Mikrolitern Hexan und Vortex-Well, um sicherzustellen, dass alle Retinoide aufgelöst sind.
Pipettieren Sie die gesamten 100 Mikroliter Hexan in das zweite Glasröhrchen und wirbeln Sie das Röhrchen, um die Retinoide aufzulösen. Pipettieren Sie dann die gesamten 100 Mikroliter Hexan in ein inertes Einzelglas für die HPLC-Analyse. Richten Sie den HPLC-Lauf unter den entsprechenden Bedingungen ein.
Identifizieren Sie Peaks anhand von Retentionszeiten und UV-Spektren für jedes Retinoid von Interesse auf der Grundlage von Standards. Integrieren Sie mit dem chromatographischen Datensystem die identifizierten Peaks und referenzieren Sie die externe Standardkurve, um den Analyten zu quantifizieren. Integrieren Sie bei biologischen Gewebechromatogrammen die Peaks manuell, um Variabilitäten in den Retentionszeiten zu berücksichtigen.
Im Chromatogramm des Kontroll-Mausauges wurden 13-cis-Retinal, 11-cis-Retinal, all-trans-Retinal, 11-cis-Retinol und all-trans-Retinol identifiziert. Im Chromatogramm des mit Hydroxylamin behandelten Mausauges waren die Retentionszeiten erhöht. Syn- und Anti-Isomere dieser Retinaldehyde waren ebenfalls vorhanden.
Im Chromatogramm des Lebergewebes von Mäusen wurden Retinylpalmitat und all-trans-Retinol als die Hauptformen von Vitamin A identifiziert, und das im Blut von Mäusen zeigte einen Trans-Retinol-Peak. Die UV-Absorptionsmittelspektren bestätigten das Vorhandensein von Retinoid-Isoformen in den Chromatogramm-Peaks.
