Die Autoren bedanken sich bei Byoung-Chul Lee, Philip Choi und Samuel Ho für wertvolle Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde bei der Molecular Foundry am Lawrence Berkeley National Laboratory, die durch das Office of Science, Office of Basic Energy Sciences unterstützt wird durchgeführt, der US-Department of Energy unter Vertrag Nr. DE-AC02-05CH11231 und die Defense Threat Reduction Agentur unter Vertrag Nr.: IACRO-B0845281.

1. Solid-Phase Submonomer Synthese von Polypeptoids Festphasensynthese (SPS) ist eine gängige Methode zur Synthese von Sequenz-spezifische Biopolymere stufenweise, direkt auf einem inerten festen Träger, wie einem polymeren Harz Perle. Hohe Kupplungsausbeuten und Leichtigkeit des überschüssigen Reaktanden Entfernung sind wichtige Vorteile der SPS. Nach einer Kupplung an das Harz werden überschüssige Reagenzien einfach abgelassen und die Perlen werden gewaschen, um bereit für den nächsten Reaktionsschritt. Nach dem abschließenden Synthese-Reaktion werden die full-length-Oligomere vom Harz abgespalten und die Lösung-Phasen-Material kann weiter untersucht werden. Hier passen wir die SPS Verfahren zur Sequenz-spezifischen Peptoid Polymere zu erzeugen. <ol><li> Setup: Alle Schritte der manuellen Peptoid Synthese kann in einem Einweg-, Polypropylen (PP) mit Fritte Patrone oder eine Glasfritte Reaktionsgefäß mit einem 3-Wege-Hahn ausgestattet ist, durchgeführt werden. Führen Sie alle Aktivitäten in einer Abzugshaube. Für Inkubationen in der glass Gefäß-oder Kunststoff-Kartusche, verbinden Sie einen Arm, um eine Versorgung mit Stickstoff, um sanft Blase die Lösung für die richtige Mischung. Alternativ zur Reaktion Inkubationen in der Einweg-Kartusche, Dichtung an beiden Enden der Patrone mit Kappen und Ort auf einem Schüttler. Um Reaktionsgemische oder wäscht drain, eine Verbindung zum Vakuum über eine Siphon Haus. Das Schiff sollte mit einer groben Fritte Fritte werden. Siliconpastenfilme Glasreaktionsgefäß um Perlen vom Kleben an den Wänden des Glases zu vermeiden. Bereiten Sie eine Lösung von 5% Dichlordimethylsilan in Dichlorethan (v / v). Füllen Sie eine saubere und trockene Reaktionsgefäß bis zum Rand mit Silikonisierung Lösung, lassen Sie sich für 30 Minuten, dann abtropfen lassen. Waschen Sie den Behälter einmal mit DCE und dann noch einmal mit Methanol. Die Silikonisierung Lösung wiederverwendet werden können, so dass es gespeichert werden soll. Entweder an der Luft trocknen oder abzuschütteln überschüssige Lösung und backen Sie die Glaswaren, bis es trocken nach dem Entfernen der Hahn. Coole Reaktionsgefäß vor dem Hinzufügen von Harz. </li><li> Fügen Sie 100 mg (0,06 mmol) der Rink-Amid-resin eine Fritte Reaktionsgefäß. Swell das Harz durch Zugabe von 2 ml Dimethylformamid (DMF). Agitieren durch Schütteln oder sprudelnden für 10 Minuten. Lassen Sie die Lösung durch Vakuum an die schwoll Harz zu isolieren. </li><li> 1 ml 20% 4-Methyl-piperidin in DMF (v / v), um die Fmoc-Gruppe entschützen. Agitieren für 2 Minuten und abtropfen lassen. Wiederholen Sie mit einem 12-minütigen Inkubation. </li><li> Spülen Sie das Harz durch Zugabe von 2 mL DMF, Rühren für 15 Sekunden, und Entleeren. Wiederholen Sie die 3x. </li><li> Bromoacetylation: 1 ml von 0,6 M Bromessigsäure (0,6 mmol) in DMF und 86 ul von N, N&#39;-Diisopropylcarbodiimid (0,93 Äquivalent, 0,56 mmol). Inkubieren unter leichtem sprudelnden für 30 Minuten, dann abtropfen lassen und gründlich mit 2 ml DMF (Wiederholung 4x). </li><li> Hubraum: 1 ml von 1-2 M Amin in N-Methylpyrrolidinon. Inkubieren mit blubbernden für 30-120 Minuten, dann abtropfen lassen und gründlich mit DMF (4x 2 ml). </li><li> Fahren Sie mit dem Peptoid Kette durch Wiederholung der Submonomer Zyklus, Schritte 1,5 (bromoacetylation) und 1,6 (displacemen wachsent). </li></ol><ol start="8"><li> Nach der endgültigen Vertreibung geschehen ist, mit 2 ml DMF (Wiederholung 4x) abspülen, dann 2 mL Dichlormethan (repeat 3x). Cap und speichern das Reaktionsgefäß bis Spaltung. </li><li> Pause in der Synthese (optional): So halten Sie während eines Peptoid Synthese, beenden Sie die Verschiebung Reaktion und weiter auf 1,8 Schritt. Um weiter zu wachsen die Peptoid Kette, starten die Synthese von re-Schwellung des getrockneten Harzes (Schritt 1,2) und das Wiederholen der Submonomer Zyklus (Schritt 1,5 und 1,6). Das Harz kann getrocknet und gelagert werden, nachdem jede Verschiebung mit Ausnahme der 2. Verschiebung, weil das Harz-Peptoid Konjugat eine zyklische Diketopiperazin Nebenprodukt bilden können. </li><li> Für mehrere gleichzeitige Synthese, ist eine Festphasenextraktion Vakuumkammer empfohlen, um die Effizienz zu maximieren. Peptoid Synthese kann auch durch geeignete Programmierung Methoden in handelsüblichen Peptidsynthesizern, wie die Aapptec Apex 396, CEM Mikrowellen-Synthesizer Liberty-und Protein Techno automatisiert werdenlogien Inc. Prelude Synthesizer. </li></ol> 2. Spaltung und Side-Chain Entschützung <ol><li> Übertragen Sie alle getrockneten Harz zu einem 20 mL Szintillations Glasfläschchen. </li><li> Arbeiten in einer Kapuze und Verwendung der richtigen persönlichen Schutzausrüstung, 4 ml Trifluoressigsäure (TFA)-Spaltung Cocktail 1 (z. B. 95% aq. TFA, siehe Diskussion), die Szintillation Glasfläschchen und fest verschließen. Schütteln für 10 Minuten bis 2 Stunden bei Raumtemperatur (siehe Diskussion). </li><li> Sammeln Sie die TFA-Spaltung Lösung durch Filtrieren des Harzes durch eine Einweg-, PP Fritte Patrone in eine neue, vorher gewogenen 20 mL Szintillations Glasfläschchen. Ein Einweg-, PP-Pipette ist zweckmäßig, die Spaltung Cocktail-Lösungen übertragen. </li><li> 1 ml frischer Spaltung Cocktail an das Harz gründlich und sammeln restliche Peptoid. Wiederholen Sie 2x. </li><li> Man dampft TFA durch Einblasen eines leichten Stickstoffstrom oder mit einem Biotage V10 Verdampfer. </li><li> Abgeblasen, und der Rohöl in 6 mLAcetonitril / Wasser 1:1 (v / v) für die HPLC. Freeze und lyophilisiert. Wiederholen. </li><li> Das Gewicht des Rohproduktes. Shop als trockenes Pulver bei -20 ° C </li><li> Test-Spaltung (optional): Ein Test-Spaltung auf 0,5% des Harzes kann durchgeführt werden, um schnell festzustellen, die Reinheit und die Masse der synthetisierten Peptoid und ob korrekte Spaltung Bedingungen wurden gewählt werden. Testen Sie Spaltungen sind besonders nützlich, um den Fortschritt der Synthese überwachen. </li></ol> 3. Charakterisierung und Reinigung der Polypeptoid <ol><li> Durch eine Kombination von analytischen HPLC-Elektrospray LC-MS und / oder MALDI-TOF, bestimmen die Reinheit des Rohproduktes und ob das gewünschte Molekulargewicht vorhanden ist. </li><li> Bereiten Sie ein ~ 5-10 mg / ml-Lösung des trockenen Peptoid Pulver in Wasser mit minimalem Acetonitril als für die Löslichkeit benötigt. Filter klare Lösung von rohem Peptoid Produkt mit 0,45 um Spritzenfilter, um Staub und Partikel zu entfernen. </li><li> Analytische HPLC und Elektrospray LC-MS: Vorbereiten einer ~ 20 pg / mL Rohöl Peptoid Lösung. Filter 200 ul mit einem 0,45 um Filter und injizieren 20 uL. </li><li> MALDI: Mix 1 ul ~ 20 mg / mL Peptoid mit 1 ul-Matrix. Spot 1 ul auf MALDI Platte und an der Luft trocknen. Matrix und den Erwerb Modus ist abhängig von Probe (Abb. 5). </li><li> Das rohe Peptoid Mischung mit Reverse-Phase-HPLC prep. Wählen Sie die Steigung und Spalte (C4 oder C18) auf der Hydrophobie polypeptoid basiert. Kombinieren gereinigten Fraktionen, eingefroren, und lyophilisiert, was zu einem flauschigen weißen Pulver. Das Gewicht des Endproduktes. </li><li> Die Bildung von HCl-Salz (optional): abgeblasen, und der lyophilisierten Pulvers in 100 mM HCl (aq.) mit minimalem Acetonitril. Transfer zum vorgewogen Glasfläschchen. Freeze und re-lyophilisieren. Wiederholen Sie 2x. Erneut gewogen, um Masse Peptoid Pulver zu bestimmen. </li></ol> 4. Peptoid Nanosheet Formation Dieser Abschnitt describes das Protokoll, um Blätter von einem single-chain, Sequenz-spezifischen, amphiphile 36-mer Peptoid (Abb. 1). Nach dem Peptoid Strang synthetisiert, gereinigt und lyophilisiert, wie oben beschrieben, wird die erhaltene weiße Pulver in DMSO gelöst, um eine 2 mM Stammlösung zu machen. <ol><li> Bereiten Sie 500 mL der 20 uM Peptoid Lösung in Blattbildung Puffer (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8,0 in Wasser) in einem 1 Dram Glasfläschchen. Fügen Sie zunächst 445 ul des Milli-Q Wasser, 50 uL 10x Blattbildung Puffer und Wirbel zu mischen. Anschließend 5 pl 2 mM Peptoid Stammlösung und schwenken Lösung. Cap der Glasflasche. </li><li> Die Bettwäsche wird durch die sanfte Bewegung des verdünnten wässrigen Peptoid Lösung gebildet. Langsam Kippen der Glasflasche aus der horizontalen Lage in die aufrechte Position führt zu Rate ziehen. Leichtem Schütteln ergibt sich auch Blätter, jedoch neigen die Blätter sind kleiner und mit weniger geraden Kanten. Eine gründlichere Analyse der Blattbildung Mechanismus ist Reported getrennt. 2 </li><li> Für viele hochwertige Bettwäsche, drehen Sie das Glasfläschchen um die horizontale Achse langsam (&lt;1 min) für 1-3 Tage. Eine geeignete technische Mittel RKVSD Rotamix Rohr Rotator oder ein individuelles Wippe kann dies kontinuierlich durchzuführen. </li><li> Dialyse von Nanoschichten (optional): Bei bestimmten Anwendungen kann es notwendig sein, um jede freie Peptoid Ketten oder Puffer / Salze zu entfernen. Tränken Sie ein Float-a-Lyzer 100 kD-Membran in die gewünschte Puffer für 15 Minuten. Legen Sie 500 ul Peptoid Blatt-Lösung in den Probenraum. Tauchen Sie ein in 500 mL des gewünschten Puffer, Rühren mit einem Magnetrührer bei 60 Umdrehungen pro Minute. Lassen Dialyse von Blechen bis 4 Stunden gehen. Jede Stunde, den Austausch mit einem frischen Stamme der Pufferlösung. </li></ol> 5. Fluoreszenz-Mikroskopie von Nanoschichten <ol><li> Fluoreszenz-Bilder von der Nanoschichten wurden mit Nile Red, einem ökologisch sensiblen Farbstoff, dessen Fluoreszenzintensität steigt, wenn es in hydr lokalisiert ist abgebildetophobic Umgebungen (Abb. 2). </li><li> Add 1 ul 100 uM Nile Red und 100 ul der nanosheet Lösung auf eine Endkonzentration von 1 uM Nile Red zu erhalten. </li><li> Machen Sie einem 1% igen Lösung in heißem Wasser vermischen und in einer Kunststoff-Petrischale. Sicherstellen, dass die Agarose-Lösung beträgt etwa 1 / 8 Zoll dick und lassen Sie die Lösung abkühlen auf eine ebene Fläche ungestört. Nach der Agarose-Sets, mit einem Spatel zu schneiden und je 1 cm x 1 cm große Quadrate auf ein Glasplättchen. </li><li> Um das Blatt in der gleichen Ebene, Spot 1 ul Blatt Lösung auf dem Stück Agarose zu sammeln. Lassen Sie die Agarose auf den Puffer für 2 Minuten absorbieren, so dass die Blätter an der Oberfläche. Bild innerhalb von 15 Minuten, sonst wird die Agarose beginnt sich zu verformen wegen Austrocknung. </li><li> Um Bild-Blätter in der Lösung, Last 15 ul in einem 20 mm Durchmesser 0,12 mm Dichtung auf einem Glasträger. Deckel mit einem Deckglas. Wenn die Blätter einfach liegen zwischen einem Glasträger und Deckglas ohne eine Dichtung eingelegt, viele Blätter will Scher-und die scheinbar geringfügige Verdunstung bewirkt, dass die Platten ständig verschieben. </li><li> Bild Blatt unter Epifluoreszenz-Beleuchtung (z. B. eine Olympus IX81 inversen Mikroskop mit einem Andor iXonEM + EMCCD-Spektren mit einem Texas-Rot-Filter eingebaut). </li></ol> 6. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) von Nanoschichten <ol><li> Plasma Etch von Silikon-Substrat (optional): Die Silizium-Chips sind Plasma geätzt werden, um bei der Adsorption von Blatt zu unterstützen. Legen Sie die Silizium-Chips in der Vakuumkammer eines Plasma-Reiniger (zB Harrick Plasma Cleaner / Sterilisator PDC-32G). Pump bis zu 200 mTorr und stellen Sie die HF-Spule bis 18W (hohe Einstellung für PDC-32G). Etch für 2 Minuten. </li><li> Drop 20 uL Peptoid Blatt-Lösung auf einem Plasma-behandelten Silizium-Substrat. Lassen Sie sich für 3 Minuten sitzen. Entfernen Sie überschüssige Lösung mit der Spitze des Kim-wischen. Je 20 ul Wasser auf die Oberfläche und entfernen Sie überschüssige Lösung wieder in den Puffer und Salze zu entfernen. Wiederholen 4x. </li><li> Alternativ wählen SieYZE die Peptoid Blatt Lösungen gegen Wasser zu puffern und Salz zu entfernen. Drop 20 uL dialysiert Blatt Lösung auf Plasma behandelte Silizium-Substraten. An der Luft trocknen Probe. </li><li> Bild Blätter mit SEM (zB Zeiss Gemini-Ultra-Analytical-55 Scanning Electron Microscope) mit einer in-lens-Detektor und Strahlenergien zwischen 1 kV und 5 kV (Abb. 3). </li></ol> 7. Sicherheitshinweise: <ol><li> Dimethylformamid und Dichlormethan sind recht Verdachtskategorie. </li><li> N, N&#39;-Diisopropylcarbodiimid, 4-methylpiperdine und Bromessigsäure sind gefährlich für die Haut, Augen und Atemwege. Sie sollten in der Haube mit Vorsicht verwendet werden. Es kann sein, giftig beim Einatmen oder durch die Haut absorbiert, und die Belichtung kann in Sensibilisierung führen. Leere Behälter enthalten Produktreste (Flüssigkeit / Dampf) und sollte gründlich, bevor sie aus der Motorhaube gespült werden. </li><li> TFA ist eine starke Säure, und ist extrem schädlich für die oberen Atemwege, Augen undHaut. TFA ist auch volatile-halten konzentrierte Lösungen von TFA in die Haube zu allen Zeiten der Atemwege zu vermeiden. Verwenden Sie eine korrekte PPE, und Vorsicht beim Umgang mit Lösungen von TFA. Wechseln Sie die Handschuhe sofort, wenn sie kommen in Kontakt mit TFA, und sofort Verschüttetes. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Dieser Abschnitt beschreibt die Synthese, Charakterisierung und Reinigung einer Sequenz-spezifischen 36-mer Peptoid Kette, faltet sich zu einer hoch geordneten nanosheet 3 (Abb. 1). Der Block-charge Peptoid H-[Nae-NPE] 9 - [NCE-NPE] 9-NH 2 wurde auf 100 mg Rink-Amid-Harz synthetisiert. A 2 M Amin-Lösung wurde für alle Verdrängungsreaktionen, das für 60 Minuten Rückstand 1-18 und 120 Minuten für Rückstände 19-36 durchgeführt wurden verwendet. t-Butyl Beta-Alanin HCl wurde die freie Base (siehe Diskussion) umgewandelt, während phenethylamine und Boc-Ethylendiamin wurden beide verwendet directly. Das Harz wurde mit 95% TFA, 2,5% triispropylsilane, 2,5% Wasser für 2 Stunden gespalten. TFA wurde eingedampft und der erhaltene viskose Öl (~ 180 mg) wurde in 6 ml Acetonitril wieder gelöst: Wasser 1:1 (v / v). Produktreinheit (Abb. 4) und die Präsenz des Produktes Masse wurde von der analytischen RP-HPLC (30-80% Acetonitril in Wasser-Gradienten, die beide mit 0,1% (v / v) TFA, mit 1 ml / min über 30 Minuten bestätigt bei 60 ° C mit einem C18, 5 um, 50 X 2 mm Spalte) und MALDI (Abb. 5). Reinigung mit Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C18-Säule (10 mu m, 22 mm x 250 mm) ging, mit einem Gradienten von 30-60% Acetonitril in Wasser mit 0,1% TFA über 60 Minuten bei 10 mL / min. Die Säule wurde mit 60 mg Rohprodukt für jeden chromatographischen Lauf geladen. Die gereinigten Fraktionen wurden basierend auf Reinheit der analytischen RP-HPLC (Abb. 4) vereinigt und lyophilisiert, um ~ 80 mg eines flauschigen weißen Pulver. Gereinigtes Block-charge Peptoid molekularenGewicht wurde durch MALDI bestätigt. 1 ul 100 uM gereinigt Peptoid in Acetonitril: Wasser 1:1 (v / v) wurde mit 1 ul der Matrix (5 mg / ml α-cyano-4-Hydroxy-Säure in Acetonitril gemischt: Wasser 1:1 v / v und 0,1% TFA) und 1 ul war auf der MALDI Platte entdeckt. Nachdem die Probe an der Luft getrocknet, war es in der Applied Biosystem / MDS SCIEX 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer platziert. Die Erfassung und Verarbeitung Modi wurden linear mit geringer Masse. Der errechnete Gewicht wurde in der gezielten Masse eingegeben werden, um automatisch die Verzögerungszeit anpassen. Die Laserintensität wurde bis 3400 eingestellt. Die beobachtete Masse, 4981,2, Streichhölzer eng mit der berechneten Masse von 4981,74. Das lyophilisierte gereinigt Pulver wurde in DMSO gelöst, um eine 2 mM Stammlösung, die bei 4 gespeichert werden können ° C machen Blätter wurden von der vorstehenden Vorschrift hergestellt und abgebildet mit der Fluoreszenz-Mikroskopie und SEM (Abb. 2 und 3). Eine Vielzahl von Formen mit Strukturgrößen von bis zu 300 pm beobachtet werden, und notably, sind gerade Kanten im Vordergrund. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig1.jpg" /> Abbildung 1 Ablauf der Block-charge Peptoid H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. A single-chain-, Block verantwortlich, amphiphile polypeptoid 36-mer selbst montiert in höchst geordnete, zweidimensionale Nanoschichten 3. Die berechneten Molekulargewicht 4981,74. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig2.jpg" /> Abbildung 2. Fluoreszenzmikroskopaufnahme Peptoid Nanoschichten. Blätter wurden von einem 20 uM Peptoid Lösung in 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0 gebildet. Die Platten wurden auf Agarose mit 1 &amp;mgr; Nile Red abgebildet. Scale-Bars sind 100 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig3.jpg" /> Abbildung 3. Rasterelektronenmikroskopie Bildervon Peptoid Nanoschichten. Blätter wurden von einem 20 uM Peptoid Lösung in 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0 gebildet. Scale-Bars sind 5 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig4.jpg" /> Abbildung 4: Analytische RP-HPLC Spur von H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. Das rohe und gereinigte analytischen HPLC-Spur (30-80% Steigung mit 1 ml / min über 30 Minuten bei 60 ° C mit einem C18, 5 um, 50 x 2 mm Spalte) des rohen und gereinigten Block-charge Peptoid H-[ Nae-NPE] 9 - [NCE-NPE] 9-NH 2 dargestellt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig5.jpg" /> Abbildung 5 MALDI-TOF Massenspektroskopie Spur von H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. Die beobachtete Masse, 4981,2, wird in enger Abstimmung auf die berechnete Masse 4981,74.

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+nanomolar+ligands+for+7-transmembrane+G-protein+coupled+receptors+from+a+diverse+(N-substituted)glycine+peptoid+Library.">Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein coupled receptors from a diverse (N-substituted)glycine peptoid Library.</a> J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).</li><li>Alluri, P., Liu, B., Yu, P., Xiao, X., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+coactivator-binding+peptoids+from+a+combinatorial+library.">Isolation and characterization of coactivator-binding peptoids from a combinatorial library.</a> Moleular Biosystems. 2, 568-579 (2006).</li><li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+N-(substituted)glycine+peptoid+libraries.">Synthesis of N-(substituted)glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li><li>Culf, A. S., Ouellette, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+synthesis+of+N-substituted+glycine+oligomers+(&amp;alpha;+peptoids)+and+derivatives.">Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (&amp;alpha; peptoids) and derivatives.</a> Molecules. 15, 5282-5335 (2010).</li><li>Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+unprotected+heterocyclic+side+chains+into+peptoid+oligomers+via+solid-phase+submonomer+synthesis.">Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Anwendungen und Bedeutung Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Synthese Peptoid und die wässrige self-assembly der Peptoide in Nanoschichten. Die meisten Labors sind leicht synthetisieren können Peptoide weil kostengünstige Materialien, grundlegendes Know-how und unkompliziert Techniken 4 sind eingesetzt. Auch die Selbstorganisation von ultra-dünnen, hoch geordneten Nanoschichten erfordert lediglich wiederholt Kippen ein Fläschchen einer verdünnten wässrigen Peptoid Lösung 2. Peptoide sind vielversprechende Materialien für biomedizinische und Nanowissenschaft, weil sie robust und synthetisch flexible und dennoch Sequenz-spezifische und gut einstellbare 5 sind. Peptoide haben biologische Aktivität (Therapeutika 6,7, Diagnose 8, intrazelluläre Abgabe 9-10) und Falten in hierarchische Nanostrukturen 3, 11-14 gezeigt. Aufgrund ihrer modularen Synthese, kombinatorische Peptoid librWidder 15-19 können leicht hergestellt werden und gesiebt für eine breite Reihe von Aktivitäten oder Eigenschaften. Insbesondere dienen die Nanoschichten als mögliche Plattform für zweidimensionale Darstellung Gerüste, Membran-Mimetika, biologische Sensoren, Protein-Mimetika und Bauteilen. Mit der praktisch unerschöpflich verschiedenen Sequenzen möglich ist, wird das Reich der Peptoid Forschung schnell expandiert. Variablen in fester Phase Submonomer Synthese von polypeptoids Aufgrund der Fähigkeit, von einem unglaublich großen und vielfältigen Alphabet der Monomere 20 Wählen Sie muss die Submonomer Methode gelegentlichen Modifikationen für Fälle, in denen die Erhöhung der Kopplungseffizienz jedem Schritt das gesamte Produkt-Ausbeute zu verbessern. Der Einbau von ungeschützten heterocyclischen Seitenketten erfordert die Verwendung von Chloressigsäure statt Bromessigsäure 21. Erweiterte Verschiebung und höhereAmin-Konzentrationen sind in der Regel nach etwa 20 Kupplungen für lange Peptoid Sequenzen oder weniger nucleophile Amine. Heizung Reaktionsgefäß auf 35 ° C, mit einem Wasser-ummanteltes Reaktionsgefäß, hilft, die Reaktion zu fahren. Für hoch-flüchtige Amine wie Isopropylamin, muss darauf geachtet werden, um Verdunstung zu vermeiden. Amine in Form einer HCl-Salz, wie t-Butyl-Beta-Alanin HCl, müssen frei-basierte, bevor sie in die Verschiebung Reaktion eingeführt. Dies kann durch Lösen oder Suspendieren des Amins in DCM (~ 5g amine/25 mL DCM), und Neutralisierung mit einer äquimolaren Lösung von Natronlauge in einen Scheidetrichter erreicht werden. Die DCM Schicht wird gesammelt und die wässrige Schicht ist mit zusätzlichen DCM gewaschen. Die kombinierte DCM-Schichten werden über Natriumsulfat getrocknet und filtriert in einen vorher gewogenen Rundkolben. Entfernen von Rotationsverdampfung Lösungsmittel, um ein Öl ergeben, und notieren Sie das Produkt Gewicht. During der Spaltung Schritt TFA-Spaltung Cocktail und Spaltung ist abhängig von der Anzahl und Vielfalt der Schutzgruppen verwendet. Richtlinien für die Spaltung Cocktails sind ähnlich zu traditionellen Peptid Entschützung Spaltungen 1. Im Allgemeinen sind 10 Minuten Inkubation bei Sequenzen ohne Schutzgruppen oder Sequenzen mit wenigen sehr säurelabile Schutzgruppen (z. B. BOC, Trityl) erforderlich. Zwei Stunden Inkubationen für Sequenzen mit schwieriger Schutzgruppen (zB t-Butyl-Ester, Mtr, Pbf) oder Sequenzen mit vielen Schutzgruppen empfohlen, sich Entschützung jeder Kette gewährleisten. Crude Peptoid Produkte werden in der Regel in Acetonitril lösen: Wasser 1:1 (v / v), aber höher Acetonitril Proportionen sind häufig mit Seitenketten mit einem insgesamt hohen Hydrophobizität.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Dimethylformamid </td><td> EMD </td><td> EM-DX1726P-1 </td><td> 99 +% </td></tr><tr><td> N-Methylpyrrolidinon </td><td> BDH </td><td> BDH1141-4LP </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Bromessigsäure </td><td> Acros Organics </td><td> 200000-106 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> 4-Methylpiperidine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M73206 </td><td> 96% </td></tr><tr><td> N, N&#39;-Diisopropylcarbodiimid </td><td> Chem-Impex </td><td> 001100 </td><td> 99,5% </td></tr><tr><td> Dichlormethan </td><td> EMD </td><td> EMD-DX0835 </td><td> ACS-Qualität </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> EMD </td><td> EM-AX0145P-1 </td><td> 99,8% </td></tr><tr><td> Trifluoressigsäure </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T6508 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Triisopropylsilan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 233781 -10G </td><td> Für TFA-Spaltung </td></tr><tr><td> 1,2-Dichlorethan </td><td> JT Baker </td><td> JTH076-33 </td><td> Für Silikonisierung von Glas-Reaktionsgefäße </td></tr><tr><td> Phenethylamine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 407267-100ML </td><td> &gt; 99,5% Hydrophobe Seitenketten-Amin </td></tr><tr><td> Boc-Ethylendiamin </td><td> CNH Technologies </td><td> C-1112 </td><td> Kationische Seitenketten-Amin </td></tr><tr><td> t-Butyl Beta-Alanin HCl </td><td> Chem-Impex International </td><td> 04407 </td><td> Anionische Seitenketten-Amin </td></tr><tr><td> α-Cyano-4-Hydroxy-Säure </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C8982-10X10MG </td><td> Für MALDI-Matrix </td></tr><tr><td> Nile Red </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 19123-10MG </td><td> Für Fluoreszenz-Imaging </td></tr><tr><td> Dichlordimethylsilan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 80430-500G-F </td><td> Für Silikonisierung von Glas-Reaktionsgefäße </td></tr><tr><td> Einweg PP Fritte WarenkorbGrat </td><td> Applied Separations </td><td> 2416 </td><td> 6 mL Polypropylen-Kassette mit 20 mm PE Fritte </td></tr><tr><td> Einweg-3-Wege-Luer-Adapter </td><td> Cole Parmer </td><td> 31200-80 </td><td> Hahn für Einweg manuelle Synthese Reaktionsgefäß </td></tr><tr><td> Luer-Lock-Ring </td><td> Cole Parmer </td><td> 45503-19 </td><td> ¼ &quot;-Anschluss für Einweg manuellen Synthese Reaktionsgefäß </td></tr><tr><td> Fittings Luer </td><td> Cole Parmer </td><td> 45500-20 </td><td> ¼ &quot;-Anschluss für Einweg manuellen Synthese Reaktionsgefäß </td></tr><tr><td> Einweg PP Pipetten </td><td> VWR </td><td> 16001-194 </td><td> Für TFA Transfers </td></tr><tr><td> Luer-Lock-Kunststoff-Spritze </td><td> National Scientific </td><td> S7515-5 </td><td> 6 ml-Spritzen </td></tr><tr><td> 1 Dram Glasfläschchen </td><td> VWR </td><td> 66011-041 </td><td> Mit Phenol-Schraubkappe mit Polyvinyl-faced Zellstoff-Liner geformt </td></tr><tr><td> 20 mL SCINDestillation Fläschchen </td><td> VWR </td><td> 66022-060 </td><td> Mit angebautem PP Kappe und Zellstoff Folieneinlage </td></tr><tr><td> Secure-Seal Klebstoff spacer </td><td> Invitrogen </td><td> S-24736 </td><td> Für Fluoreszenz-Imaging </td></tr><tr><td> Glasträger </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 63411 </td><td> Für Fluoreszenz-Imaging </td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td><td> Für Fluoreszenz-Imaging </td></tr><tr><td> 4 &quot;Silicon Wafer </td><td> Ted Pella </td><td> 16007 </td><td> Pre-Würfel in 5x7 mm-Chips </td></tr><tr><td> 0,45-Filter </td><td> VWR, Acrodisc </td><td> 28143-924 </td><td> Für die HPLC. PTFE-Membran </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> BD </td><td> 212272 </td><td> Für Fluoreszenz-Imaging </td></tr><tr><td> SPE Vakuum Manifold </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 57044 </td><td> Beispiel SPE Vakuumkammer </td></tr><tr><td> Glasfritte Schiff </td><td> Ace Glas </td><td> 6402-12 </td><td> Porosität CFritte </td></tr><tr><td> Plasma Cleaner / Sterilisator </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Beispiel Plasma-Reiniger, um Silizium-Chips für SEM vorbereiten </td></tr></tbody></table>

solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets

Peptoide sind eine neue Klasse von biomimetischen, nicht-natürliche, Sequenz-spezifischen Heteropolymere dass Proteolyse zu widerstehen, weisen starke biologische Aktivität und falten sich in höherer Ordnung Nanostrukturen. Strukturell ähnlich Peptide sind Peptoide Poly N-substituierten Glycine, wo die Seitenketten an den Stickstoff gebunden sind und nicht die alpha-Kohlenstoff. Ihre einfache Synthese und strukturelle Vielfalt ermöglicht das Testen der grundlegenden Konstruktionsprinzipien zu de-novo-Design und Engineering von neuen biologisch aktiven und nanostrukturierter Materialien hin zu fahren. Hier ist eine einfache manuelle Peptoid Syntheseprotokoll vorgestellt, ermöglicht die Synthese von langkettigen polypeptoids (bis 50mers) in sehr guten Ausbeuten. Nur Grundausstattung, einfache Techniken (z. B. flüssig übertragen, Filtration), und im Handel erhältlichen Reagenzien benötigt werden, so dass Peptoide einem zugänglichen Neben vielen Forschern Toolkits. Die Peptoid Backbone ist ein Monomer in einer Zeit, v gewachsenia der Submonomer Methode, die von einem zweistufigen Monomerzugabe Zyklus besteht aus: Acylierung und Verdrängung. Zunächst Bromessigsäure in situ mit N aktiviert, Acylate N&#39;-Diisopropylcarbodiimid ein Harz-gebundenen sekundären Amins. Zweitens nucleophile Verdrängung des Bromids durch ein primäres Amin folgt vor, um die Seitenkette einzuführen. Die Zwei-Schritt-Zyklus wird so lange wiederholt, bis die gewünschte Kettenlänge erreicht ist. Die Kopplungseffizienz dieser zweistufigen Zyklus regelmäßig mehr als 98% und ermöglicht die Synthese von Peptoide solange 50 Reste. Sehr abstimmbaren, präzise und chemisch unterschiedlicher Sequenzen sind erreichbar mit dem Submonomer Methode als Hunderte von leicht verfügbaren primären Aminen direkt integriert werden können. Peptoide sind als vielseitige biomimetische Material für nanobioscience Forschung wegen ihrer synthetischen Flexibilität, Robustheit Schwellenländern und die Bestellung auf atomarer Ebene. Die Faltung eines single-chain, amphiphile, InformationenTION-rich polypeptoid zu einem hoch geordneten nanosheet wurde kürzlich demonstriert. Diese Peptoid ist ein 36-mer, die nur aus drei verschiedenen im Handel erhältlichen Monomeren besteht: hydrophobe, kationische und anionische. Die hydrophobe phenylethyl Seitenketten sind in der nanosheet Kern begraben, während die ionischen Amin-und Carboxyl-Seitenketten auf der hydrophilen Gesichter auszurichten. Die Peptoid Nanoschichten dienen als mögliche Plattform für Membran-Mimetika, Protein-Mimetika, Bauelementherstellung und Sensoren. Methoden zur Synthese Peptoid, Blattbildung und Mikroskopie werden beschrieben und bieten eine einfache Methode, um zukünftige Peptoid nanosheet Designs.

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Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Eine einfache und allgemeine manuelle Peptoid Syntheseverfahren mit Grundausstattung und kommerziell erhältlichen Reagenzien beschrieben, so dass Peptoide problemlos in den meisten Labors synthetisiert werden. Die Synthese, Reinigung und Charakterisierung eines amphiphilen Peptoid 36mer beschrieben, sowie deren Selbstorganisation zu hoch geordneten Nanoschichten.

Solid-Phase Submonomer Synthese von Peptoid Polymere und ihre Self-Assembly in hoch geordneten Nanoschichten

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

solid-phase-submonomer-synthesis-peptoid-polymers-their-self-assembly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

29.1K Aufrufe.  Lawrence Berkeley National Laboratory. Eine einfache und allgemeine manuelle Peptoid Syntheseverfahren mit Grundausstattung und kommerziell erhältlichen Reagenzien beschrieben, so dass Peptoide problemlos in den meisten Labors synthetisiert werden. Die Synthese, Reinigung und Charakterisierung eines amphiphilen Peptoid 36mer beschrieben, sowie deren Selbstorganisation zu hoch geordneten Nanoschichten.

Serie: Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

Formgedächtnis-Polymere für Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Forschung

Biotechnik

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do not have suitable autologous donor vessels due to disease progression or previous harvest. The aim of vascular tissue engineering is to develop a suitable alternative source for these bypass grafts. In addition, engineered vascular tissue may prove valuable as living vascular models to study cardiovascular diseases. Several promising approaches to engineering blood vessels have been explored, with many recent studies focusing on development and analysis of cell-based methods.2-5 Herein, we present a method to rapidly self-assemble cells into 3D tissue rings that can be used in vitro to model vascular tissues.
To do this, suspensions of smooth muscle cells are seeded into round-bottomed annular agarose wells. The non-adhesive properties of the agarose allow the cells to settle, aggregate and contract around a post at the center of the well to form a cohesive tissue ring.6,7 These rings can be cultured for several days prior to harvesting for mechanical, physiological, biochemical, or histological analysis. We have shown that these cell-derived tissue rings yield at 100-500 kPa ultimate tensile strength8 which exceeds the value reported for other tissue engineered vascular constructs cultured for similar durations (&lt;30 kPa).9,10 Our results demonstrate that robust cell-derived vascular tissue ring generation can be achieved within a short time period, and offers the opportunity for direct and quantitative assessment of the contributions of cells and cell-derived matrix (CDM) to vascular tissue structure and function.

This article outlines a versatile method to create cell-derived tissue rings by cellular self-assembly. Smooth muscle cells seeded into ring-shaped agarose wells aggregate and contract to form robust three-dimensional (3D) tissues within 7 days. Millimeter-scale tissue rings are conducive to mechanical testing and serve as building blocks for tissue assembly.

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Each year, hundreds of thousands of patients undergo coronary artery bypass surgery in the United States.1 Approximately one third of these patients do ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Die Herstellung einer Dipole-unterstützte Festphasenextraktion Microchip für die Spurenanalyse in Wasserproben

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

Synthese von Gold-Nanopartikeln Integrated Photo-responsive Liposomen und Messung ihrer Mikroblasen Kavitation auf Pulse Laseranregung

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), their ultimate clinical use has been hampered by the lack of biologically-relevant degradation observed for most smart materials. This is particularly true for temperature-responsive hydrogels, which are almost uniformly based on polymers that are functionally non-degradable (e.g., poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) or poly(oligoethylene glycol methacrylate) (POEGMA)). As such, to effectively translate the potential of thermoresponsive hydrogels to the challenges of remote-controlled or metabolism-regulated drug delivery, cell scaffolds with tunable cell-material interactions, theranostic materials with the potential for both imaging and drug delivery, and other such applications, a method is required to render the hydrogels (if not fully degradable) at least capable of renal clearance following the required lifetime of the material. To that end, this protocol describes the preparation of hydrolytically-degradable hydrazone-crosslinked hydrogels on multiple length scales based on the reaction between hydrazide and aldehyde-functionalized PNIPAM or POEGMA oligomers with molecular weights below the renal filtration limit. Specifically, methods to fabricate degradable thermoresponsive bulk hydrogels (using a double barrel syringe technique), hydrogel particles (on both the microscale through the use of a microfluidics platform facilitating simultaneous mixing and emulsification of the precursor polymers and the nanoscale through the use of a thermally-driven self-assembly and cross-linking method), and hydrogel nanofibers (using a reactive electrospinning strategy) are described. In each case, hydrogels with temperature-responsive properties similar to those achieved via conventional free radical cross-linking processes can be achieved, but the hydrazone cross-linked network can be degraded over time to re-form the oligomeric precursor polymers and enable clearance. As such, we anticipate these methods (which may be generically applied to any synthetic water-soluble polymer, not just smart materials) will enable easier translation of synthetic smart materials to clinical applications.

Protocols are described for the fabrication of degradable thermoresponsive hydrogels based on hydrazone cross-linking of polymeric oligomers on the bulk scale, microscale, and nanoscale, the latter for preparation of both gel nanoparticles and nanofibers.

Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele auf mehreren Längenskalen über reaktive Extrusion, Mikrofluidik, Selbstmontage und Elektrospinnen

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...

Aqueous Droplets Used as Enzymatic Microreactors and Their Electromagnetic Actuation

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In conventional lab-on-a-chip-platforms, solvents and samples are passed through defined microfluidic channels with complex flow control installations. The droplet actuation platform presented here is a promising alternative. With it, it is possible to move a liquid drop (microreactor) on a planar surface of a reaction platform (lab-in-a-drop). The actuation of microreactors on the hydrophobic surface of the platform is based on the use of magnetic forces acting on the outer shell of the liquid drops which is made of a thin layer of superhydrophobic magnetite particles. The hydrophobic surface of the platform is needed to avoid any contact between the liquid core and the surface to allow a smooth movement of the microreactor. On the platform, one or more microreactors with volumes of 10 &#181;L can be positioned and moved simultaneously. The platform itself consists of a 3 x 3 matrix of electrical double coils which accommodate either neodymium or iron cores. The magnetic field gradients are automatically controlled. By variation of the magnetic field gradients, the microreactors' magnetic hydrophobic shell can be manipulated automatically to move the microreactor or open the shell reversibly. Reactions of substrates and corresponding enzymes can be initiated by merging the microreactors or bringing them into contact with surface immobilized catalysts.

Lab-in-a-drop reaction systems allow the versatile implementation of complex reactions in a microfluidic scale. An automated actuation platform consisting of a 3 x 3 matrix of electromagnetic coils was developed and successfully used to merge two 10 &#181;L microreactors and thereby initiate an enzymatic reaction in the resulting liquid marbles.

Wässrige Tröpfchen als enzymatische Mikroreaktoren und deren elektromagnetischen Betätigung

For the successful implementation of microfluidic reaction systems, such as PCR and electrophoresis, the movement of small liquid volumes is essential. In ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Synthese von kationisiertem Magnetoferritin für ultraschnelle Magnetisierungs von Zellen

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Technik Molekulare Erkennung mit Bio-Mimetikum Polymers auf einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhrchen

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...