<p class="jove_content"&gt; Die Autoren möchten sich Jennifer Strange und Greg Bauman für ihre Hilfe bei Durchflusszytometrie-Analyse und-sortierung zu danken. Diese Arbeit wurde von den NIH Grant Number 2P20 RR020171 aus dem NCRR und von der University of Kentucky Startup-Fonds FM unterstützt; GIE erkennt die Unterstützung des Präsidiums und der Graduate Fellowship Kentucky Chance Fellowship.</p

1. Isolierung von humanen peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus Buffy-Coat- <ol><li> Erwerben Sie eine Einheit der Buffy-Coat aus dem Krankenhaus oder in der Nähe Blut im Stadtzentrum. Unser Blut Zentrum bietet uns etwa 40-60 ml Buffy-Coat pro Einheit von normalen Blutspendern gewonnen. </li><li> Gießen Sie das Blut in einer autoklavierten 500 ml Glasflasche mit sterilem PBS zu verdünnen Buffy-Coat. Das Endvolumen des PBS + Leukozytenmanschette sollte 250 ml sein. </li><li> Füllen Sie zehn 50 ml konische Röhrchen mit je 20 ml Lymphoprep Lösung. </li><li> Sanft überlagern die Lymphoprep Lösung mit 25 mL der verdünnten buffy coat, man aufpassen, nicht um die Lymphoprep Lösung zu stören. </li><li> Spin Röhrchen für 30 Minuten bei Raumtemperatur bei 500 xg. Achten Sie darauf, um das Gerät auszuschalten Zentrifuge die Bremse, so dass keine Störung der Lymphozyten-Fraktion. </li><li> Collect die PBMCs an der Grenzfläche zwischen dem Lymphoprep und die Plasma-mittleren Schichten mit einer Pipette. Saugen Sie den Plasma-Medium aus, bis etwa 1 mlbedeckt die Buffy-Coat-Schicht, die die PBMCs. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette zu PBMCs auf ein neues 50 ml Tube zu übertragen. </li><li> Waschen der Zellen zweimal mit PBS gewaschen und dann resuspendiert Zellen in 50 ml kaltem RPMI zum Zählen auf einem Hämocytometer. Typische Erholung ist 8 x 10 8 - 1 x 10 9 PBMCs. </li></ol> Dieses Verfahren kann sich für kleinere Mengen an Blut skaliert werden. Verdünnung von Vollblutproben ist 1:1 in PBS. 2. Magnetische negativen Selektion von insgesamt CD4 + T-Zellen, CD4 + CD45RA + naiven T-Zellen oder CD4 + CD45RO + Memory T-Zellen aus PBMCs unter Verwendung EasySep Enrichment Kit (Stem Cell Technologies) Schritte für 1 x 10 8 bis 4,25 x 10 8 PBMCs folgen. <ol><li> Resuspendieren PBMCs zu einer Endkonzentration von 5 x 10 7 pro ml in PBS mit 2% FBS und 1 mM EDTA. Bewegen Sie Zellen in ein frisches 14 ml Polypropylen-Röhrchen mit rundem Boden. <ol class = &quot;lalpha&quot;&gt; <li> Isolierung von Gesamt-humanen CD4 + T-Zellen durch negative Selektion: add menschlichen CD4 + T-Zell-Enrichment Cocktail von Antikörpern (50 ul pro ml PBMCs), mischen und inkubieren Sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Isolierung von humanen naiven T-Zellen durch negative Selektion: add 50 ul anti-CD45RO Antikörper pro ml PBMC Zellsuspension, mischen und inkubieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur. In Anreicherung Cocktail mit dem Bausatz (50 ul pro ml PBMCs), homogenisiert und Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten zur Verfügung gestellt. </li><li> Isolierung von menschlichen Gedächtnis-T-Zellen durch negative Selektion: add menschliche Gedächtnis CD4 + T-Zell-Enrichment Cocktail von Antikörpern (50 ul pro ml PBMCs), mischen und inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Mischen magnetischer Teilchen auch gleich zu verteilen diese in der gesamten Lösung. Nicht vortexen Nanopartikeln aus naiv-Kit. </li><li> In der magnetischen Teilchen (100 ul pro ml PBMCs für insgesamt CD4 + und naive T-Zell-Auswahl, 50 ul pro ml PBMCs für Gedächtnis-T-Zell-Auswahl). Durch vorsichtiges Pipettieren 2-3 mal und Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten für naive T-Zell-Auswahl oder 5 Minuten für insgesamt Speicher oder CD4 + T-Zell-Auswahl. </li><li> In PBS mit 2% FBS und 1 mM EDTA, um die Lautstärke bis zu 10 ml pro Röhrchen zu bringen. Durch vorsichtiges Pipettieren 2-3 mal, bevor Sie nicht begrenzten Schlauch in Silber EasySep Magnet für 5, 10 oder 2,5 Minuten für insgesamt CD4 + T-Zellen, naiven und Gedächtnis Teilmengen jeweils. </li><li> Mit Schlauch noch in EasySep Magnet, gießen Flüssigkeit in neue 50 ml Tube zu interessierenden Zellen zu isolieren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 für eine bessere Erholung. </li></ol> 3. Cell Culture Bedingungen zur Induktion regulatorischer T-Zellen <ol><li> Der Tag vor den Schritten 1 und 2, Mantel Gewebekulturplatten durch erste Verdünnen Anti-CD3-Antikörper (Klon OKT3) zu einer Konzentration von 1 pg / ml in sterilem PBS. Für eine 6-Well-Platte 2 mL PBS + Anti-CD3 pro Well hinzugefügt, für eine 12-Well-Platte 1 ml oder für eine 24-Well-Platte hinzufügen 500 ul pro Well. Halten die beschichtete Platte bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Planen Polarisationsmedium durch Zugabe von 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 50 uM β-Mercaptoethanol in RPMI-1640 mit 2,06 mM vor ergänzt Glutamax-I und 25 mM HEPES-Puffer. Als Nächstes fügen 2 ng / ml TGF-β und 5 ng / ml IL-2. Hier kann man hinzufügen, Liganden oder Inhibitoren von Interesse für die Medien. Die Zellen aus Schritt 2 in einer Konzentration von 2 × 10 6 Zellen / ml Polarisationsmedium. </li><li> Pre-warmen Platten bei 37 ° C und saugen Sie den PBS von anti-CD3-beschichteten Vertiefungen vor dem Hinzufügen Zellen. In 4 ml pro Vertiefung der Zellsuspension für eine 6-Well-Platte, 2 ml Zellen für eine 12-Well-Platte oder 1 ml Zellen für eine 24-Well-Platte. Füllen Sie leere Vertiefungen mit PBS, um Verdunstung zu reduzieren vonMedien. Inkubieren für 3 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Am Tag 3 nach der Beschichtung, Spin-down-Platte in einer Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g. Ohne Störung T-Zellen am Boden der Platte, die Hälfte von Medien und ersetzen Sie sie durch frische Medien. Alternativ, wenn der gut wird überfüllt mit Zellen (Konzentration von mehr als 3 x 10 6 / ml), teilen Sie die Lautstärke gleichmäßig in eine andere anti-CD3 beschichteten Platte, und fügen Sie frisches Medium wieder auf ursprünglichen Volumens. Inkubieren für zwei bis drei Tage bei 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> 4. Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) von drei Populationen von T-Zellen <ol><li> Planen FACS Waschpuffer durch Zugabe von 0,5% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA zu sterilem PBS. Platz Puffer bei 4 ° C bis kalt. </li><li> Entfernen Zellen aus der Zellkultur gut und spülen jedes Well mit 2 ml PBS, um eine vollständige Erholung der Zellen zu gewährleisten. Legen Sie alle Zellen in 50 ml Polypropylen-Röhrchen und zentrifugieren bei 500 xg für 10Minuten bei 4 ° C </li><li> Zählen der Zellen in einem Hämozytometer auf die Zelldichte zu bestimmen. </li><li> Platz 3-5 x 10 5 Zellen pro Röhrchen in vier getrennten 5 ml Rundboden Polystyrol-Röhrchen für die Entschädigung Kontrollen. Legen verbleibenden Zellen in 50-ml-Polypropylenröhrchen, nicht mehr als 35 x 10 6 Zellen pro Röhrchen. </li><li> Spin-Down-Zellen für 5 Minuten bei 4 ° C und absaugen Medien. Die Zellen in 90 ul kaltem Waschpuffer pro 1 × 10 6 Zellen sortiert werden. Resuspendieren in 100 &amp;mgr; l kaltem Waschpuffer die Kompensations-Röhren. </li><li> Um die Zellen sortiert werden, kombinieren 2 &amp;mgr; l Anti-CD25-PE, 3 ul von anti-CD45RA-PE-Cy5 und 1 ul anti-CD127-APC pro 1 x 10 6 Zellen. In keine Antikörper gegen den ersten Kompensationswert Steuerrohr, 2 ul Anti-CD25-PE mit dem zweiten Rohr, 3 ul Anti-CD45RA - PE-Cy5 mit dem dritten Rohr and1 ul Anti-CD127-APC an den vierten Schlauch. Alle Röhrchen auf Eis für 45 Minuten im Dunkeln. </li><li&gt; 10 ml kaltem Waschpuffer zu den Zellen sortiert wird, und 1 ml der Kompensations-Röhrchen. Zentrifuge alle Zellen bei 500 xg für 5 Minuten bei 4 ° C </li><li> Saugen Puffer und resuspendieren Zellen bei einer Konzentration von 1 x 10 7 Zellen pro ml Waschpuffer. In 1,5 ul DNase II pro ml Zellen vor der Filterung durch eine 40 uM Nylon Zellsieb. Bewegen Zellen mehrere 5 ml Rundkolben Polypropylenröhrchen mit nicht mehr als 3,5 ml pro Röhrchen. Resuspendieren Entschädigung Kontroll-Zellen in 300 ul Waschpuffer. </li><li> Setzen Sie auf Entschädigung MoFlo Durchflusszytometer zu Cross-Erkennung durch das PE, APC und PE-Cy5-Filter zu minimieren. Stellen Sie Toren iTregs (CD25 CD127 Hallo -/LOW CD45RA - Zellen) zu sortieren, naive (CD25-CD45RA +) und Speicher (CD25 - CD45RA -) T-Zellen in 5 ml Rundboden Polystyrol-Röhrchen mit 1 ml Serum von neugeborenen Kälbern. </li></ol> 5. Unterdrückung Assay <ol><li> Machen SUPPRMultisession Testmedien durch Zugabe von 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 5 ng / ml IL-2 und 2 ng / ml TGF-β zu AIM-V. </li><li> Der Tag des Tests, zu reinigen heterologen CD4 + T-Zellen aus Buffy-Coat-wie in den Schritten 1 und 2 angegeben. Diese werden die Zielzellen zur Unterdrückung Assay und enthält keine CD25 + Treg Zellen, wie in 2, Tag 0 zu sehen ist. </li><li> Label-Zellen mit CellTrace Kit nach den Anweisungen des Herstellers, mit der Ausnahme, nur 1 ul 5 mM Stammlösung pro ml Zellen anstelle von 2 ul. Fernhalten von direktem Licht, fügen Sie 18 ul des DMSO durch die CellTrace Kit geliefert, um ein Fläschchen mit CFSE, um eine 5 mM Stammlösung zu machen. Resuspendieren die erforderliche Anzahl von Zielzellen (maximal 1 x 10 7) in vorgewärmtem PBS + 0,1% (w / v) BSA in einer Endkonzentration von 1 × 10 6 Zellen / ml. Fügen Sie 1 ul 5 mM CFSE pro ml Zellen und Inkubation bei 37 ° C im Wasserbad für 5 minutes. In 5 Volumina abgeschlossen, eiskaltes RPMI mit 10% FBS zu löschen Färbung und Inkubation auf Eis für 5 Minuten. Waschen der Zellen noch zweimal mit kaltem komplettem RPMI resuspendieren und 1 x 10 5 Zellen pro 100 ul der Unterdrückung Assay Medien. </li><li> Treg-Unterdrückung Inspektor Perlen sind an einer Börse Konzentration von 2 x 10 7 Beads / ml. Pellet eine Anzahl von Kugeln gleich der gesamten Anzahl der Zellen pro Experiment praktischen Zentrifugation in einer Eppendorf-Röhrchen. Waschen Perlen einmal mit RPMI und Re-Pellet. Nach Aspiration von RPMI, resuspendieren Perlen, so dass die entsprechende Menge an Perlen pro Well sind in 8 ul der Unterdrückung Assay Medien. </li><li> Um eine 96-Well Rundboden Gewebekulturplatte, fügen CFSE-gefärbten Zellen (1 x 10 5 Zellen / ml), Inspektor Perlen und polarisiert und sortierten Zellen (1 x 10 5 Zellen / ml) in frischem Unterdrückung Assay Medien zu einem gewünschten Ziel (CFSE gebeizt): Manipulator (sortiert)-Verhältnis in einem Endvolumen von 200 ul. Alle Bedingungen sind in dreifacher gesetztCates. </li><li> Bereiten Sie den ersten von zwei Kontrollbedingungen durch Zugabe von 100 L CFSE gefärbten Zellen, 8 ul Inspektor Perlen und 1 x 10 5 von frischen, ungefärbten Zellen in 92 ul-Suppressor-Assay-Medium pro Vertiefung. Bereiten Sie die zweite Steuereinheit mit den gleichen zellulären Komponenten wie oben, jedoch ohne Treg-Inspektor Perlen. </li><li> Abdeckplatte in Alufolie und bei 37 ° C / 5% CO 2 für fünf Tage. </li><li> In der Dunkelheit sammeln Zellen aus jeder Vertiefung durch Pipettieren und in einen 5 ml Rundboden-Röhrchen Polystyrol. Zentrifuge Zellen bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 ° C, Überstand Medien und Resuspension in 300 ul kalten FACS Waschpuffer aus Schritt 4. Analysieren Sie die ersten 3 x 10 4 CFSE + Ereignisse aus der Live-Lymphozyten-Gate vertreten Zielzellen in einem Histogramm mit Cell Quest-Software. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Beispiel für durchflusszytometrische Pseudocolor Dot-Plots über einen Fünf-Tage-couBörse Überwachung iTreg Differenzierung der relativen Co-Expression von CD25 mit FoxP3 basiert, kann CTLA-4 und CD45RA in 2 gesehen werden. Das Histogramm in Abbildung 3 zeigt eine erfolgreiche Unterdrückung Test, bei dem iTregs (CD25 Hallo CD45RA - CD127 -/LOW Zellen) sortiert. Sind die einzige Teilmenge aus einer Fünf-Tage-Kultur, die regulatorischen / Suppressor-Fähigkeit erworben hat, Abbildung 4 zeigt die Induktion von Tregs aus einer naiven T-Zell-Pool (obere Bilder) und einem Speicher-T-Zell-Pool (untere Bilder), nach fünf Tagen Kultur in Standard iTreg Medium. CFSE Färbung der ursprünglichen Zellen nachweisen, dass entweder naiv (oben rechts) oder Memory T-Zellen (unten rechts) zu iTregs (höchste Foxp3-exprimierenden Zellen) zu differenzieren erst nach mehreren Runden der Zellteilung. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Verfahren. PBMCs are aus humanen peripheren Blut über Zentrifugation abgetrennt, bevor magnetischen negativen Selektion von CD4 + CD25 - T-Zellen. Nach fünf bis sechs Tagen in Kultur, Zellen unterzogen und mit FACS heterologen CFSE markierten Ziel-Zellen co-inkubiert, um Suppressor-Aktivität zu messen. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" /> 2 Gereinigte humane primäre CD4 + CD25 -. T-Zellen in iTreg Medium kultiviert. Ein Aliquot der Zellen nur nach der Isolierung (Tag 0) und an den Tagen 1, 3 und 5 der Zellkultur gesammelt, um den Fortschritt von CD45RA, FoxP3, CTLA-4 und CD25-Marker zu überwachen. Die iTreg Profil entspricht CD45RA -, FoxP3 Hallo, CTLA-4 und CD25 Hallo Hallo (hervorgehoben in der in-Graph-Fenster). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" /> Abbildung 3. Gereinigten CD4 + CFSE lamarkierter Zellen (1 × 10 5 / Well) mit Treg Unterdrückung Inspektor Kügelchen in der Anwesenheit von sortierten naiven, Speicher oder iTreg kultiviert (3 x 10 4 / Vertiefung). Nach fünf Tagen werden die Zellen geerntet und das Profil der CFSE gefärbten Zellen wird mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Anwesenheit von iTreg Zellen vollständig aufhebt Proliferation von CD4 + T-Zellen. Zahlen sind bezeichnend für Prozentsatz der CFSE-markierten Zellen, die Teilung erfahren haben. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" /> Abbildung 4 Gereinigte humane primäre naiv. (CD4 + CD25 - CD45RA +) und Speicher (CD4 + CD25 - CD45RO +) T-Zellen werden mit CFSE und kultiviert in iTreg Medium gefärbt. Nach fünf Tagen werden die Zellen phänotypisiert und die Zellteilung Raten geschätzt. Wie in 2 gezeigt, entspricht die iTreg Teilmenge aus beiden Teilmengen differenziert, umCD45RA - CD25 FoxP3 Hallo Hallo und CTLA-4 Hallo (letzteren beiden nicht gezeigt). Vergleichende CFSE Färbung Profile identifizieren iTregs (hier als den höchsten Ausdruck FoxP3 T-Zellen) als die proliferative Zellen während der Fünf-Tage-Kultur.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Während Treg Transfer birgt ein enormes therapeutisches Versprechen im Kampf gegen Autoimmunität Transplantatabstoßung und anderen Immunerkrankungen oder entzündlichen vermittelten Erkrankungen, Methoden für ihre effiziente Erzeugung und Aufrechterhaltung stabiler sind noch nicht entwickelt worden. Da nur 1-5% der zirkulierenden humanen T-Zellen Tregs sind, überwindet ihre kontrollierte Expansion und Differenzierung dieser Mangel als eine große Abschreckung der Umsetzung der Tregs in die Klinik. Auf der anderen S...

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Axis-Shield </td><td> 1114547 </td><td> Halten Sie bei Raumtemperatur </td></tr><tr><td> Gekühlte Tischzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5810R </td><td></td></tr><tr><td> Leuchtrahmen Hämocytometer </td><td> Hausser Scientific </td><td> 3110 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Humane CD4 + T-Zell-Enrichment Kit </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19052 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Human Memory CD4 + T-Zell-Enrichment Kit </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19157 </td><td></td></tr><tr><td> EasySep Menschliche naiven CD4 + T-Zell-Enrichment Kit </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 19155 </td><td></td></tr><tr><td> The Big Easy EasySep Mag.Netto- </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 18001 </td><td> Silber </td></tr><tr><td> 5 ml Rundboden Polystyrol-Röhrchen </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen </td><td> VWR </td><td> 89004-368 </td><td></td></tr><tr><td> 14 ml Polypropylen-Rundboden-Röhrchen </td><td> BD Falcon </td><td> 352059 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen </td><td> VWR </td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche Anti-CD3-Antikörper </td><td> Bio X Zelle </td><td> BE0001-2 </td><td> Klon: OKT3 </td></tr><tr><td> 24 Well Polystyrol Zell Kulturplatte </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 96 Well Rundboden Gewebekulturplatte </td><td> Grenier Bio-One </td><td> 650180 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 mit Glutamax-I-und HEPES-Puffer </td><td> Gibco </td><td> 72400 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinantes humanes TGF-β1 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8348-62 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinantes humanes IL-2 </td><td> eBioscience </td><td> 14-8029-63 </td><td></td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin (BSA) </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 810531 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA </td><td> Amresco </td><td> E177 </td><td></td></tr><tr><td> Maus anti-human CD25-PE </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-024 </td><td> Klon: 4E3 </td></tr><tr><td> Maus Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 </td><td> eBioscience </td><td> 15-0458-42 </td><td> Klon: HI100 </td></tr><tr><td> Maus anti-human CD127-APC </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-094-890 </td><td> Klon: MB15-18C9 </td></tr><tr><td> DNase II </td><td> MP Biomedicals Inc. </td><td> 190370 </td><td></td></tr><tr><td> MoFlo Durchflusszytometer </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FlowJo Software </td><td> Baum-Star, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cell Quest Pro Software </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Serum von neugeborenen Kälbern </td><td> Gibco </td><td> 16010 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> AIM-V </td><td> Gibco </td><td> 0870112 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit </td><td> Invitrogen </td><td> C34554 </td><td></td></tr><tr><td> Treg-Suppression Inspector Perlen </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-909 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 40 uM Nylon ZellstammER </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr></table>

generation of induced regulatory t cells from primary human na&iuml;ve and memory t cells

Die Entwicklung und Pflege von immunsuppressiven CD4 + regulatorischen T-Zellen (Tregs) Mitwirkung an der peripheren Toleranz notwendig, um in immunologischen Homöostase mit der großen Menge von sich selbst und kommensalen Antigene in und auf den menschlichen Körper verbleiben. Störungen in der Balance zwischen Treg und entzündlichen konventionellen T-Zellen können in Immunpathologie oder Krebs führen. Obwohl therapeutische Injektion von Tregs gezeigt wurde, dass sein in Mausmodellen der Colitis 1, Diabetes Typ I 2, rheumatoider Arthritis und graft versus host disease, 4 einige grundlegende Unterschiede in der menschlichen Biologie im Vergleich zu Maus Treg 5 wirksam ist bislang klinischen Einsatz ausgeschlossen. Das Fehlen einer ausreichenden Zahl, Reinheit, Stabilität und Spezifität der therapeutischen Homing Tregs erforderte eine dynamische Plattform des menschlichen Treg Entwicklung, auf denen Voraussetzungen für ihre ex vivo Expansion von 6 bis zu optimieren. Hier we describe ein Verfahren zur Differenzierung von induzierten Tregs (iTregs) aus einem einzigen menschlichen peripheren Blut-Donor, bei dem in vier Stufen unterteilt werden: Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen, magnetische Selektion von CD4 + T-Zellen in vitro Zellkultur und Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) von T-Zell-Untergruppen. Da die Treg Unterschrift Transkriptionsfaktors forkhead box P3 (FOXP3) ist ein Aktivierungs-induzierten Transkriptionsfaktor beim Menschen 7 und keine andere einzigartige Marker vorhanden ist, eine kombinatorische Panel von Markern muss verwendet werden, um T-Zellen mit Suppressor-Aktivität zu identifizieren. Nach sechs Tagen in Kultur, kann Zellen in unserem System in naive T-Zellen, Gedächtnis-T-Zellen oder iTregs ihrer relativen Expression von CD25 und CD45RA Basis abgegrenzt werden. Als Erinnerung und naiven T-Zellen unterschiedlicher Polarisation berichtet Anforderungen und Plastizitäten 8 haben, Vorsortierung des ursprünglichen T-Zell-Population in CD45RA + und CD45RO + Teilmengen können be verwendet, um diese Unstimmigkeiten zu prüfen. In Übereinstimmung mit anderen, unsere CD25 Hallo CD45RA - iTregs Express ein hohes Maß an FoxP3 9, GITR und CTLA-4-11 und geringe Mengen an CD127 12. Nach FACS jeder Population, kann resultierenden Zellen in einer Suppressor-Assay, der die relativen Fähigkeit, die Proliferation von Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE)-markierten autologen T-Zellen verzögert bewertet werden.

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Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

Wir beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen regulatorische, Speicher und naive T-Zellen aus einem einzelnen menschlichen Blutspender. Polarisierten Tregs können dann auf andere Teilmengen in einer Vielzahl von genetischen und funktionelle Anwendungen mit genetische Homogenität, einschließlich einer Unterdrückung Assay auch hier detailliert verglichen werden.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

23.9K Aufrufe.  University of Kentucky. Wir beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen regulatorische, Speicher und naive T-Zellen aus einem einzelnen menschlichen Blutspender. Polarisierten Tregs können dann auf andere Teilmengen in einer Vielzahl von genetischen und funktionelle Anwendungen mit genetische Homogenität, einschließlich einer Unterdrückung Assay auch hier detailliert verglichen werden.

Serie: Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Forschung

Immunologie und Infektion

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

In vitro Differenzierung von humanen CD4 + FOXP3 + Induced regulatorischer T - Zellen (iTregs) von Naïve CD4 + T - Zellen unter Verwendung eines TGF-β-enthaltende Protokoll

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.