Unser Laborprotokoll ermöglicht die Kombination von Humangenom-Editing mit CAR-T-Zelltherapie. Das Laborverfahren ist der Ansatz mit CRISPR-Cas9, bis zu drei Gene mit hoher Effizienz anzusprechen. Und schließlich kann unser Ansatz in klinische Studien am Menschen übersetzt werden.
Die beschriebenen Methoden können auf andere CAR-Konstrukte und Zielgene angewendet werden. Die Grundlagen der Techniken sind robust genug, um in größerem Maßstab und an akademische und industriell tätige Mitarbeiter für die weitere Entwicklung übersetzt zu werden. Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal versuchen, begrenzen Sie die Anzahl der Gruppen im Guide-RNA-Bildschirm, um genaue Inkubationszeiten zu ermöglichen.
Die Einhaltung der Kulturbedingungen und der beschriebenen Aussaatdichte haben sich nach unserer Erfahrung als entscheidend erwiesen. Zunächst erhalten Sie autologe periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von gesunden freiwilligen Spendern und isolieren CD4- und CD8-positive T-Zellen mit handelsüblichen CD4- und CD8-Selektionskits. Kombinieren Sie CD4-positive und CD8-positive T-Zellen in einem Verhältnis von eins zu eins und inkubieren Sie 3 Millionen Zellen pro Milliliter in R10, ergänzt mit 5 Nanogramm pro Milliliter jedes menschlichen IL7 und menschlichen IL15 über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Tag zählen Sie die T-Zellen und zentrifugieren 5 bis 10 Millionen Zellen bei 300 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie alle Überstände und waschen Sie das Zellpellet in reduzierten seruminsen minimalen essentiellen Medien. Suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern nuklearer Zuneigungslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Bereiten Sie beim Waschen der Zellen ein Ribonukleoprotein oder RNP-Komplex vor, indem Sie 10 Mikrogramm Cas9-Nuklease mit 5 Mikrogramm Einzelleiter-RNA für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie eine Simuliertkontrolle ohne Einzelleiter-RNA ein. Kombinieren Sie die re-suspendierten Zellen mit dem RNP-Komplex und fügen Sie 4,2 Mikroliter von vier mikromolaren Elektroporationsverstärkern hinzu.
Gut mischen und in Elektroporationsküvetten überführen. Elektroporate der Zellen mit dem Pulscode EH111, dann inkubieren Sie 5 Millionen Zellen pro Milliliter in R10, ergänzt mit 5 Nanogramm pro Milliliter menschlichem IL7 und menschlichem IL15 bei 30 Grad Celsius für 48 Stunden in 12 Wellplatten. Fahren Sie nach der Inkubation mit der T-Zellaktivierung und -expansion fort.
Entwerfen Sie die Sequenzierungsprimer, indem Sie die Sequenz des PCR-Amplicons in eine Standard-Primer-Design-Software eingeben. Die Design-Software schlägt mehrere Primersequenzen vor, die für die Sanger-Sequenzierung geeignet sind. Wählen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die mindestens 150 Basenpaare vor oder nach der gRNA-Schnittstelle mit dem Amplicon binden, um eine gute Sequenzierungsqualität um die Indels zu gewährleisten.
Verwenden Sie die TIDE-Analyse, um die Knockout-Effizienz auf genomischer Ebene zu erkennen. Der Algorithmus rekonstruiert genau das Spektrum der Indels aus den Sequenzspuren und berechnet R-Quadratwerte. Nach der Aktivierung werden T-Zellen in Kultur expandiert und für zukünftige Studien kryokonserviert.
Während der Erweiterung werden die Verdopplung der Population und Volumenänderungen im gesamten Protokoll sowohl für Mock- als auch für bearbeitete CAR-T-Zellen verfolgt. Während der Expansion wurden keine signifikanten Veränderungen in der Proliferation und Aktivierung festgestellt. Sobald die Zellen kryokonserviert waren, wurden die Konzentrationen der CAR-Expression für weitere funktionelle Studien sowohl für die simulierten bearbeiteten als auch für die Knockout-CAR-T-Zellen bestimmt.
Es wurden keine signifikanten Veränderungen beobachtet. Die Knockout-Effizienz kann mit mehreren Techniken bestimmt werden. In diesen repräsentativen Durchflusszytometrie-Diagrammen wurden die PDCD1- und TRAC-Loci mit Single-Guide-RNA anvisiert, was eine Effizienz von 90% für die PDCD1-Single-Guide-RNA und 98% für die TRAC-Single-Guide-RNA über mehrere gesunde Spender zeigte.
Es ist wichtig sicherzustellen, dass die molaren Verhältnisse von Cas9 und Führungs-RNAs genau sind. Während des Eingriffs sollten die Zellen immer bei vier Grad Celsius gehalten und nicht über längere Zeit in der Elektroporationslösung belassen werden. Nach der CAR-Konservierung können die CRISPR-entwickelten CAR-T-Zellen für in-vitro- und in-vivo-funktionelle Assays wie Zytotoxizitätstests, Zytokinproduktion und syngenetische oder Xenograph-Tumormausmodelle verwendet werden.
Unser Ansatz mit crispR Cas9-Technologie wird nun auch auf klinische Studien angewendet. Der Ansatz kann sowohl bei Krebs als auch bei nicht-malignen genetischen Störungen wie Hämoglobinophatien eingesetzt werden, von denen Millionen von Kindern und Erwachsenen weltweit betroffen sind.
