Die Autoren möchten sich an die US Army Medical Research und Materiel Command danken (Grant # W81XWH-10-1-0806) und die National Institutes of Health (Grant # U19 AI091031-01 und Grant # 1R01GM090280) für finanzielle Unterstützung. BN erkennt die Balloun Professur für Chemie-und Bioingenieurwesen und NLBP Wilkinson erkennt die Professur für Interdisziplinäre Engineering. Wir danken Julia Vela für ihre Hilfe bei der Durchführung der Nanopartikel-Funktionalisierung Experimente.

1. Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten <ol><li> Vor der automatisierten Synthese dimannoside, eine entsprechend geschützte Zuckerdonor, typischerweise Trichloracetimidat, und Akzeptor, vor allem eine Alkenylgruppe fluorierten Alkohol, auf dem Arbeitstisch synthetisiert. </li><li> Ein Programm wurde für die automatisierte Synthese von dimannoside geschrieben. Eine schematische Darstellung der grundlegenden automatisierten Verfahrens ist in 2 dargestellt. In dem Programm, wird sichergestellt, dass vor der Zugabe des Promotors, die Mischung von Donor und Akzeptor für mindestens 30 min gerührt. </li><li> Lösungen des synthetischen Donor, Akzeptor und Trimethylsilyltrifluoromethansulfonat werden in Dichlormethan hergestellt. Toluol und Dichlormethan werden am häufigsten für Glycosylierungen verwendet. </li><li> Außerdem werden die Lösungen der Reagentien für die Schutzgruppenabspaltung der temporären Schutzgruppen in 80% Methanol und 100% Methanol. </li><li> Vor dem Beginn des Programms, sicherzustellen, dass der jeweiIVE Luftfeuchtigkeit im Raum ist 30% oder weniger in der Automatisierung Kammer. Hohe Luftfeuchtigkeit ist schädlich für Glycosylierungsreaktionen. </li><li> Sobald das Programm gestartet wird, überträgt der Roboterarm die Lösungen von Donor und Akzeptor in das Reaktionsgefäß nacheinander. Dann wird die Mischung 30 Minuten lang gerührt. </li><li> Weiter der Roboterarm überträgt 0,2 bis 0,3 Äquivalente Trimethylsilyltrifluoromethansulfonat in die Mischung, typischerweise bei Raumtemperatur obwohl niedrigere Temperaturen wie -20 ° C erreicht werden kann. Das Reaktionsgemisch wird 30 min gerührt. </li><li> Nach 30 min wird die Reaktion gestoppt und ein kleines Aliquot entfernt, um die Reaktion Fortschritt zu überwachen. Wenn nicht abgeschlossen ist, kann die Reaktion fortgesetzt und schließlich die erforderliche Zeit geändert werden kann. </li><li> Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgemisch auf der fluorhaltigen Festphasenextraktion (FSPE) Kartuschen mit C 8 F 17-modifizierten Kieselgel zur Reinigung übertragen. </li><li> Der WagenRippen zunächst mit einer 80% Methanol-Wasser-Gemisch (8 ml), um die Beseitigung der Nicht-Fluorphase Fraktion gewaschen. </li><li> Dann werden die Patronen werden mit 100% Methanol gewaschen, um die gewünschte fluormarkierten Produkt zu erhalten. Wenn zusätzliche Reinigung gewünscht wird, kann die Maschine zu stoppen und das Reaktionsprodukt (en) für die Reinigung durch zusätzliche Maßnahmen entfernt werden. </li><li> Nach der Reinigung Zyklus, verzichtet der Roboterarm Natriummethylat in das Reaktionsgefäß. Die Reaktion wird für 2 Stunden gerührt. Wenn nicht abgeschlossen ist, kann die Reaktion erneut für einen längeren Zeitraum fortgesetzt werden und schließlich die programmierte Zeit erforderlich ist, geändert werden. </li><li> Nach Beendigung der Reaktion wird das Produkt durch FSPE gereinigt und dann Auflösen in wasserfreiem Toluol unterzogen, gefolgt von Verdampfung um Restwasser zu entfernen. </li><li> Anschließend beginnt der Zyklus (von Schritt 6 bis 13) wird wiederholt, bis die gewünschte Kettenlänge für das Zielmolekül erhalten wird. </li><li> Das geschützte Produkt von der Automatisierung erhalten wird, ist then weiter gereinigt und vollständig durch Techniken wie Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie charakterisiert. Totalentschützung (Entfernung aller verbleibenden Schutzgruppen) der endgültigen Zielmolekül wird dann außerhalb der Automatisierungsplattform der Regel abgeschlossen werden, da sich in der Regel explosives und Palladium. Die endgültige Entschützungsschritt wurde am Tischgerät außerhalb der Automatisierungs-Plattform durchgeführt. Der erste Schritt war Ozonolyse der Doppelbindung in fluorigen Tag durch Oxidation des gebildeten Aldehyd zu einer Carbonsäure, gefolgt. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie gereinigt. Der letzte Schritt war Entschützung Benzylethergruppen durch Palladium-katalysierten Hydrierung. Das Produkt wurde durch Celite-Pad weitergegeben loswerden Palladium auf reine Endprodukt zu bekommen. </li></ol> 2. High-Throughput-Nanopartikel-Oberfläche Funktionalisierung <ol><li> High-Throughput-Polymer-Nanopartikel-Synthese und Herstellung erfolgt nach dem gleichen PR durchgeführtotocol und Roboter einrichten beschrieben von Petersen et al 19. Die Copolymer-Systeme für die Herstellung verwendeten Partikel auf Sebacinsäure (SA) und 1,6-Bis (para-carboxyphenoxy) Hexan (CPH), und 1,8-Bis basieren ( para-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctan (CPTEG) und CPH. Eine schematische Darstellung der Roboter Abscheidungsvorrichtung verwendet wird in 1b dargestellt. </li><li> Nach Nanopartikel Herstellung wird der Halter, die Rohre mit der Nanopartikel-Bibliothek an den linearen Stellantrieb Stufe wieder befestigt werden. </li><li> Zur Befestigung von Kohlenhydraten an der Oberfläche der Teilchen Polyanhydrid, wird ein Amin-carbonsäure-Kupplung 20, bestehend aus zwei aufeinander folgenden Reaktionen durchgeführt. </li><li> Für die erste Reaktion, die Spritze in der ersten programmierbaren Spritzenpumpe mit 10 Äquivalenten (Gl.) (Äquivalente Molekulargewicht Carbonsäure Konzentration auf Partikeloberfläche) aus gefülltem 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-ca.rbodiimide Hydrochlorid (EDC) und 10 eq. Ethylendiamin in einer wässrigen Lösung, während die Spritze in der zweiten programmierbaren Spritzenpumpe mit 12 äq geladen. N-Hydroxysuccinimid (NHS) in wässriger Lösung. </li><li> Mithilfe des LabVIEW-Programm, werden Reagenz Suspensionen von Nanopartikeln in die Bibliothek * hinterlegt. </li><li> Als nächstes wird jede Probe mit Ultraschall behandelt (30 s bei 40 Hz) und der Schlauchhalter ausgewählt ist aus der Roboter-Plattform abgelöst. </li><li> Nanopartikel-Suspensionen sind für 9 h ** mit ständiger Rotation bei 4 ° C inkubiert </li><li> Nach Reaktionszeit abgeschlossen ist, werden Röhrchen zentrifugiert (12000 xg für 5 min) und kehrte in die Roboter-Station, um zwei Waschschritte durchzuführen. </li><li> Zum Waschen bleibt eine Spritze leer und mit dem in den ersten programmierbaren Spritzenpumpe, während die Spritze in der zweiten Spritzenpumpe mit kaltem Wasser gefüllt ist. Der Überstand in jedem Röhrchen wird in die leere Spritze und die zweite Pumpe Ablagerungen kaltem Wasser entzogen. </li><li> Homogenisierung von NanoPartikel-Suspension erfolgt wie in Schritt 2.6 beschrieben. Die Rohre werden dann zentrifugiert (12000 × g für 5 min) und einem zweiten Waschschritt wird durchgeführt, wie in Schritt 2.9 beschrieben. </li><li> Für die zweite Reaktion, werden zwei Schritte Abscheidung verwendet. In der ersten Abscheidungsschritt, 12 eq. EDC mit einer Pumpe und 12 eq geladen. NHS mit der zweiten Pumpe geladen. </li><li> Der zweite Schritt umfasst Abscheidung 10 eq. einer spezifischen Substanz auf den ersten und zweiten Pumpen (dh Galactose, Lactose oder Di-Mannose) *** und eine dritte Pumpe mit 10 eq. Glykolsäure (als Kontrolle verwendet ****). </li><li> Nanopartikel-Suspensionen wird homogenisiert, wie auf Schritt 2.6 beschrieben und inkubiert für 9 h mit ständiger Rotation bei 4 ° C </li><li> Nachdem die Zeit der Reaktion abgeschlossen ist, wird ein Waschschritt durchgeführt, wie in den Schritten 2.8, 2.9 und 2.10 beschrieben. </li><li> Das funktionalisierte Nanopartikel-Bibliothek wird dann in einer Vakuumkammer angeordnet, um für mindestens 2 Stunden trocknen. </li><li> Die funktionalisierten Nanopartikel werden dann CharakterIzed durch Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie und einen hohen Durchsatz Phenol-Schwefelsäure-Test, um die Oberfläche Zusammensetzung und Konzentration des Saccharids jeweils zu bestimmen. Rasterelektronenmikroskopie und dynamische Lichtstreuung werden genutzt, um Partikelgröße, Größenverteilung und Oberflächenladung zu bestimmen. </li></ol> Anmerkungen: * Deposition Volumen variieren mit der Masse von Nanopartikeln in jedem Röhrchen enthalten. ** Reaktionszeiten bei ersten und zweiten Reaktionen können geändert werden, um die endgültige Saccharidkonzentration einzustellen. Jedes Saccharid *** werden in Reagenzgläser Abhängigkeit von der gewünschten Gruppe abgeschieden. **** Für die spezifische Reaktion in dieser Studie für die Befestigung von Kohlenhydraten verwendet wird, wird Glycolsäure als Linker Kontrolle verwendet, da sich dieses Saccharide entschützten Moleküls kovalent verknüpft, die für die weitere Befestigung an Nanopartikeloberfläche zulässt. 3. Repräsentative Ergebnisse Die FULly geschützt dimannoside in Abbildung 2 dargestellt wurde unter Verwendung der Automation-Plattform. Die synthetisierte Verbindung wurde durch 1 H-NMR in einem VXR 400 MHz Spektrometer unter Verwendung von CDCl 3 als Lösungsmittel enthält. Das NMR-Spektrum ist in 3 gezeigt. Unter Verwendung des High-Throughput-Nanopartikel Herstellung und Funktionalisierung von Polyanhydrid-Nanopartikel beschrieben, hat Befestigung dimannose, Lactose und Galactose wurden erfolgreich 10, 11 durchgeführt. Mit diesem Aufbau wurden optimalen Reaktionsbedingungen (dh, der Reaktionstemperatur und Zeit) identifiziert gewünschte Funktionalisierung Nanopartikel und Morphologie zu erreichen. Wenn die Reaktion wurde bei 4 ° C statt bei Raumtemperatur, eine Verringerung Nanopartikelaggregation wurde durch SEM beobachtet (Daten nicht gezeigt). Tabelle 1 zeigt repräsentative Ergebnisse der Charakterisierung von funktionalisierten 50:50 CPTEG: CPH Nanopartikel entweder mit Di-Mannose oderLactose, bei 4 ° C synthetisiert Die Daten zeigen einen kleinen Anstieg der durchschnittlichen Durchmesser Nanopartikel aufgrund der Funktionalisierung. Während die nicht-funktionalisierte Nanopartikel einen negativen Zeta-Potential von ca.. -20 MV zeigten die funktionalisierten Partikel ein positives Zetapotential Wert und zeigt erfolgreiche Funktionalisierung der Oberfläche der Nanopartikel. Laktose und Di-Mannose beide neutralen Zuckern, doch, Diamin freien Amingruppen aus dem Ethylen-Linker verwendet werden, um die Saccharide und kann auch verantwortlich der positiven Zeta-Potential. Die Reaktionszeit ist eine weitere Variable, die sowohl die endgültige Morphologie der Nanopartikel und der Grad der Zucker Anlage erreicht beeinflussen könnten. Durch Einstellen der Reaktionszeit kann die endgültige Zuckerkonzentration an die Nanopartikel angeheftet Oberfläche gesteuert, wie in 4A gezeigt. Wie erwartet, die Konzentration des dimannose auf der Oberfläche von 50:50 CPTEG: CPH-Nanopartikel mit erhöhterdie Gesamtzeit der Reaktion und erreichte ein Maximum nach 18 Stunden. Nanopartikel mit dem 24 Stunden Gesamt-Reaktionszeit funktionalisiert wurden verwendet, um ihre Fähigkeit, auf CLRs Maus aus dem Knochenmark dendritische Zellen (DCs) gezielt zu evaluieren. Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Expression von zwei CL-Rezeptoren (dh, CIRE (CD209, DC-SIGN) und Mannose-Rezeptor (CD206)) nach Stimulation mit nicht funktionalisierten und Lactose und Di-Mannose funktionalisierte Nanopartikel (4B) zu bewerten. Eine höhere Expression der beiden Rezeptoren, die ein Hinweis auf effektive Targeting ist, wurde erhalten, wenn Zellen, die sowohl Lactose und Di-Mannose funktionalisierte Nanopartikel stimuliert wurden. Jedoch zeigten Di-Mannose-funktionalisierten Teilchen eine höhere Expression anzeigt, eine Spezifität dieses Liganden für die Rezeptoren, die untersucht wurden. <table border="1"><tbody><tr><td> Nanopartikel-Typ </td><td> Durchschnittlicher Partikeldurchmesser (nm) </td><td> AveWut Particle ζ-Potential (mV) </td></tr><tr><td> Nicht-funktionalisierte </td><td> 162 ± 43 </td><td> -20 ± 0,6 </td></tr><tr><td> Laktose </td><td> 235 ± 34 </td><td> 26 ± 2,4 </td></tr><tr><td> Di-Mannose </td><td> 243 ± 32 </td><td> 30 ± 4,2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Nanopartikelcharakterisierung. Nicht-funktionalisierte und funktionalisierte wurden durch quasi-elastische Lichtstreuung und Zetapotential Messungen charakterisiert. Partikelgrößen-Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) der dynamischen Lichtstreuung Daten in drei unabhängigen Experimenten gesammelt. Zetapotential Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Messungen. Änderung des Vorzeichens des Zetapotentials zeigt, dass Zucker war effizient, konjugiert mit dem 50:50 CPTEG: CPH Nanopartikel-Oberfläche. <img alt="1" src<html> = &quot;/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. (A) Grafische Darstellung der Ansatz mit Kohlenhydrat-Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid und ein Beispiel der funktionalisierten Nanopartikel-Bibliotheken, die mit der beschriebenen High-Throughput-Ansatz konzipiert werden konnte verfolgt. (B) Schematische Darstellung des automatisierten Abscheidungsvorrichtung zur Partikelfunktionalisierung, der aus (i) drei NE 1000 Pumpen besteht verwendet, (ii) ein Roboter-Stufe durch zwei Aktuatoren (Zaber) integriert ist: ein zur Bewegung in x-Richtung und der andere für eine Bewegung in y-Richtung, (iii) eine zweite Roboter mit jeweils zwei benachbarten Gestellen (geeignet für Rohre und Küvetten), bestehend aus drei Aktuatoren, eine für jede Richtung (x, y und z). Die Pumpen und insgesamt fünf Aktuatoren in Reihe geschaltet sind. Stellantriebe, Pumpen werden von einem Computer mit LabVIEW-Software betrieben. Diese Darstellung ist nicht maßstabsgetreu.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" /> Abbildung 2. Graphische Darstellung des automatisierten iterativen Synthese von Kohlenhydraten am Beispiel Mannose. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" /> 3. 1 H-NMR des geschützten dimannoside. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" /> Abbildung 4. (A) Wirkung der Reaktionszeit auf Nanopartikeloberfläche Konzentration von Saccharid. In den gezeigten Daten, 50:50 CPTEG: CPH wurden Nanopartikel mit dimannose zu unterschiedlichen Reaktionszeiten funktionalisiert und die Reaktion wurde bei 4 ° C Der Durchschnitt und Standardabweichung von zwei unabhängigen Experimenten Funktionalisierung gezeigt. (B) Laktose-und Di-Mannose funktionalisierte Nanopartikeleffektiv Ziel-DC-SIGN (CIRE, CD209) und Mannose-Rezeptor (CD206) auf das Knochenmark-abstammenden dendritischen Zellen, wie durch die verstärkte Expression dieser beiden Marker nach Stimulation mit funktionalisierten 50:50 CPTEG gezeigt: CPH Nanopartikel, wenn sie mit der Expression verglichen mit nicht-funktionalisierte Partikel.

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NLBP ist Mitbegründer und hält Beteiligungen in der Kohlenhydrat-Unternehmen LuCella Biosciences, Inc.

Die Wirksamkeit von Kohlenhydraten als Targeting-Agenten, um direkte Interaktionen von Nanopartikeln an Immunzellen wurde bereits 10, 11 gezeigt. Frühere Untersuchungen in unserem Labor haben gezeigt, dass spezifische Zucker an Polyanhydrid Nanopartikel können verschiedene CLR auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) ausgerichtet sind, wodurch die Aktivierung von Immunzellen, die wichtig sein kann für weitere T-Zell-Aktivierung 10, 11. Um jedoch eine optimale Ausrichtung mehrerer Parameter-wie...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Xyz: 3x T-LSM050A, 50 mm Stellweg je Achse </td><td> Zaber Technologies </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 Einzel-Spritzenpumpe </td><td> New Era Pump Systems </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * Randlose Wiederverwendbare Glas Kultur Tubes </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> ASW 1000 </td><td> Chemspeed Technologies </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> SGE Gasdichte Spritzen, Luer Loc </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> XL-2000 Sonicator </td><td> Qsonica </td><td> Q55 </td></tr><tr><td> Mini-Tube Rotator </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-450-127 </td></tr></tbody></table>

high-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles

Transdisziplinäre Ansätze unter Einbeziehung Bereichen wie Material-Design, Nanotechnologie, Chemie, Immunologie und müssen genutzt werden, um rational zu entwerfen wirksame Impfstoffe Carriern werden. Nanopartikel-basierte Plattformen können verlängert die Persistenz der Impfstoff-Antigene, die Verbesserung der Immunogenität Impfstoff könnte 1. Mehrere biologisch abbaubare Polymere sind als Impfstoffen Fahrzeugen 1 untersucht, insbesondere Polyanhydrid Teilchen die Fähigkeit zur Freisetzung von stabilen Protein-Antigene bereitzustellen und Antigen-präsentierenden Zellen zu aktivieren und zu modulieren Immunantworten 2-12 gezeigt. Die molekularen Aufbau von diesen Vakzin-Trägern muss die rationale Auswahl der Eigenschaften von Polymeren sowie den Einbau von geeigneten Zielmittel integrieren. Hoher Durchsatz automatisierter Herstellung von Targeting-Liganden und funktionalisierte Partikel ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Fähigkeit, ein breites r studieren verbessern wirdAnge von Eigenschaften und trägt zur Gestaltung von reproduzierbaren Impfstoff Abgabevorrichtungen führen. Die Zugabe von Zielliganden, die durch spezifische Rezeptoren auf Zellen erkannt wurde gezeigt, zu modulieren und Schneider Immunantworten 10,11,13 C-Typ Lektin-Rezeptoren (CLR) sind Mustererkennungsrezeptoren (PRR), die auf der Kohlenhydratgehalt erkennen Oberfläche von Krankheitserregern. Die Stimulation von Immunzellen über CLRs erlaubt eine gute Internalisierung des Antigens und anschließende Präsentation für weitere T-Zell-Aktivierung 14,15. Daher spielen Kohlenhydrat-Moleküle eine wichtige Rolle bei der Untersuchung der Immunantwort, jedoch die Verwendung dieser Biomoleküle leidet oft die mangelnde Verfügbarkeit von strukturell gut definiert und reine Kohlenhydrate. Ein Automatisierungs-Plattform auf iterative Lösung-Phasen-Reaktionen basieren, können eine schnelle und kontrollierte Synthese dieser Moleküle synthetisch herausfordernden mit deutlich niedrigeren bEBÄUDE Block Mengen als herkömmliche Festphasenmethoden 16,17. Hier berichten wir über ein Protokoll für die automatisierte Lösung-Phasen-Synthese von Oligosacchariden wie Mannose-based Targeting-Liganden mit fluorierten Festphasenextraktion für die Zwischen-Reinigung. Nach der Entwicklung von automatisierten Verfahren, um die Kohlenhydrat-Zielmittel machen, beschreiben wir für ihre Befestigung auf der Oberfläche der Nanopartikel Polyanhydrid Verwendung einer automatisierten Roboter-Einrichtung betrieben werden, wie zuvor LabVIEW 10 beschrieben. Funktionalisierung von Oberflächen mit Kohlenhydraten hat seine Wirksamkeit bei der Ausrichtung der CLRs 10,11 und die Erhöhung der Durchsatzleistung des Herstellungsverfahrens auszugraben die Komplexität mit einer multi-parametrischen Systems verbunden sind, werden von großem Wert (Abbildung 1a) gezeigt werden.

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High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

In diesem Artikel wird ein hoher Durchsatz Verfahren zur Synthese von Oligosacchariden und ihre Befestigung an der Oberfläche der Nanopartikel Polyanhydrid zur weiteren Verwendung bei der Ausrichtung der spezifische Rezeptoren auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert wird.

Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten und Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

high-throughput-synthesis-carbohydrates-functionalization

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K Aufrufe.  Iowa State University. In diesem Artikel wird ein hoher Durchsatz Verfahren zur Synthese von Oligosacchariden und ihre Befestigung an der Oberfläche der Nanopartikel Polyanhydrid zur weiteren Verwendung bei der Ausrichtung der spezifische Rezeptoren auf Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert wird.

Serie: High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Forschung

Biotechnik

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Mikrowelle gesteuerte Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für die schnelle Erkennung von Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...