<p class="jove_content"&gt; Die Arbeit wurde von der National Science Foundation (CHE-0749737) unterstützt. Das Instrument wurde von der Nutzung Massenspektrometrie Einrichtung an der University of the Pacific vorgesehen.</p

1. Vorbereitung der Musterlösungen <ol><li> Bereiten Sie zuerst die Stammlösungen des Peptids und die sechs Referenz Säuren Verwendung eines gemischten Lösungsmittels aus Methanol und Wasser in einem Volumenverhältnis 1:1. Die Stammlösungen sollte eine Konzentration von etwa 10 -3 M. </li><li> Man wiegt 1 mg des festen peptid-Probe, A 3 CH, in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und 1,0 ml Lösungsmittelgemisch aus Methanol und Wasser, und Mischen mit einem Vortex. </li><li> Abwiegen 1 mg Difluoressigsäure (DFAH) und 1,0 ml des gemischten Lösungsmittels aus Methanol und Wasser, und mischen Sie mit einem Vortex. </li><li> Verwenden Sie die gleiche Prozedur, um die Lager-Lösungen für die anderen fünf Referenz Säuren Chloressigsäure (MCAH) Bromessigsäure (MBAH), Dichloressigsäure (DCAH), dibromoacetic Säure (DBAH) und Trifluoressigsäure (TFAH) machen. </li><li> Zeichnen Sie etwa 50 ul des Peptids Stammlösung in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und ziehen etwa 50 ul der Stammlösung DFAH in den samich Eppendorf-Röhrchen. Verdünnen der Mischlösung mit 900 ul der gemischten Lösungsmittel aus Methanol und Wasser, um eine endgültige Konzentration von etwa 10 -4 M erreichen Diese verdünnte Lösung als die Probenlösung für die Massenspektren verwendet werden. Das tatsächliche Verhältnis des Peptids an der Referenz Säure sowie die endgültige Konzentration der Probelösung wird auf der Grundlage der Ionensignal Häufigkeiten im Massenspektrometer beobachtet eingestellt werden. </li><li> Verwenden Sie die gleiche Prozedur, um die Probe Lösungen des Peptids mit den anderen fünf Referenz Säuren vorzubereiten. </li></ol> 2. Massenspektrometrie 1: Proton-gebundene Cluster Ion Formation <ol><li> Der erste Schritt der Massenspektrometrie Messung ist stabil gebundene Proton Clusterionen des Peptids mit einem Referenzwert Säure zu erzeugen. </li><li> Legen Sie das Gerät in die Negativ-Ionen-MS-Modus mit der ESI-Nadel Spannung bei -4.5 kV, die Kapillare Spannung bei etwa -35 V, und der Trocknungsgastemperaturgehalten bei 150 ° C. Setzen Sie die Peakbreite Q1 und Q3 die Peakbreite sowohl auf die geeichte Waage (Die Peakbreite ist ein Instrument Parameter, die verwendet werden, um die Auflösung der Peaks anpassen kann. Die &quot;geeichte Waage&quot;-Einstellung erlaubt es, schmalen Peaks für bessere Peaktrennung anzuzeigen ). Die Kapillare Spannung und die Trocknungsgastemperatur eingestellt werden, um die beobachteten Häufigkeiten Ionen zu erhöhen. </li><li> Infuse etwa 0,5 ml der Probenlösung von Peptid-DFAH in eine 1 ml Hamilton-Spritze und verbinden Sie die Spritze mit dem ESI Nadeleinlass mit PEEK-Schlauch. Dann legen Sie die Spritze auf die Spritzenpumpe. Schalten Sie die Spritze Pumpe, um die Probe in der ESI-Nadel ziehen mit der Durchflussrate bei 10 ml / min. </li><li> Schalten Sie den ESI-Nadel Spannung an den ESI-Prozess zu aktivieren. Schalten Sie den Detektor. Ein Massenspektrum Display sollte im Profil-Modus beobachtet werden. Wenn das Display in den Schwerpunkt-Modus, um das Profil zu wechseln. Sehen Sie sich das Proton-gebundene Cluster-Ionen-Bildung durch monitoring der Peak bei m / z 428. Das Signal Fülle des Clusters Ion kann durch eine Feinabstimmung des Gerätes eingestellt werden. Ein wichtiger Parameter ist die Kapillare Spannung. Man kann manuell die Kapillare Spannung (typischerweise im Bereich von -20 bis -50 V), um die Fülle des Peaks bei m / z 428 zu maximieren. </li></ol> 3. Massenspektrometrie Messung 2: Die CID Bracketing Experimente <ol><li> Der nächste Schritt ist, die CID Klammerung Experiment durchzuführen. </li><li> Sobald die Fülle des Clusters ion den gewünschten Wert erreicht (ca. 100 mV), schalten Sie das Gerät an das MS / MS-Modus. In diesem Modus Q1 als ein Massenfilter, um die Cluster-Ionen, Q2 dient als Kollisionszelle und Q3 fungiert als Massenanalysator isolieren. </li><li> Stellen Sie die Kollision (Argon, in diesem Fall) Druck bei 0,5 mTorr und die Kollisionsenergie bei 17 eV. Drei Gipfel sollte im Massenspektrum Schaufenster beobachtet werden. Der Peak bei m / z 428 entspricht Clusterion [DFA • H • A 3 CS] ¯. Die zwei Peaks bei m / z 332 und m / z 95 zu der deprotonierten Peptid (A 3 CS ¯) und der deprotonierten Difluoressigsäure (DFA ¯) entsprechen. Die kleinerer Peak bei m / z 298 ist eine sekundäre Fragment aus dem deprotonierten Peptid. Erwerben Sie ein CID-Spektrum für 2 min, 3a. </li><li> Führen Sie ähnliche Experimente CID und erwerben ein CID-Spektrum für die Probe Lösung des Peptids mit Bromessigsäure (MBAH), 3b. </li><li> Führen Sie ähnliche Experimente CID und erwerben die CID-Spektren für die Probe Lösungen des Peptids mit allen anderen Referenz Säuren. Die resultierende CID-Spektren werden qualitativ ähnlich Fig. 3a und 3b, aber die m / z-Werte und die relativen Peak-Höhen unterschiedlich sein. </li></ol> 4. Massenspektrometrie Messung 3: Die kinetische Methode <ol><li> Der letzte Schritt ist, um die SRM-Spektren erwerben. </li><li> Schalten Sie das Spektrum Display Schwerpunkt gesetzt und das Gerät an den gewählten Reaktionsbedingungen Monitoring (SRM)-Modus. Halten m / z 428 als isolierte Ionen durch den ersten Quadrupol (Q1), und füllen vier Massen (Masse-zu-Ladungs-Verhältnisse), die von dem dritten Quadrupol (Q3) überwacht werden. Die vier Massen m / z 428 (der Cluster-Ionen) m / z 332 (das Peptid-Ionen) m / z 298 (das Fragment des Peptids Ionen) und m / z 95 (der DFA ¯ ion). Halten Sie die Kollision Gasdruck bei 0,5 Torr. </li><li> Stellen Sie die Aufprallenergie auf 11,7 eV und erwerben die Spektren für 5 min. </li><li> Ändern Sie die Aufprallenergie auf 17,6 eV und erwerben die Spektren für 5 min. </li><li> Ändern Sie die Aufprallenergie auf 23,4 eV und 29,3 eV und erwerben die Spektren an beiden Kollisionsenergien für 5 min. </li><li> Führen Sie ähnliche Messungen für das Peptid mit allen anderen Referenz Säuren. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Kopieren Sie die Werte der Ionenintensitäten von all die SRM-Spektren auf einem Excel-Arbeitsblatt. </li><li> Berechnen Sie die CID Produkt-Ion Verzweigungsverhältnisse, ln ([A ¯] / [A i ¯]), gemessen für alle sechs Protonen-gebundenen Clustern an allen vier Kollisionsenergien. Abtastwerte werden in Tabelle 1 gezeigt. </li><li> Zeichnen Sie die Werte von ln ([A ¯] / [A i ¯]) gegen die Werte der Δ Säure H i - Δ Säure H durchschnittl. Dies gibt vier Parzellen entsprechend den Daten auf vier Kollisionsenergien, 4a. </li><li> Entpacken Sie die Werte von den Pisten und fängt durch lineare Regression der vier Parzellen. In diesem Fall sind die Steigungen positive Werte und der Abschnitte entsprechen negative Werte. Geben Sie dem Symbol &quot;X&quot; auf die Piste und das Symbol &quot;Y&quot;, um die fängt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Multiplizieren Sie die Werte von Y mit -1 und verwenden Sie das Symbol Y &#39;, um die positiven Werte stellen (dies erlaubt die y-Achse zu disspielen positive Werte). Beachten Sie, dass diese Umwandlung optional, solange die entsprechenden Werte verwendet werden, um das Grundstück für den nächsten Schritt zu machen. </li><li> Plotten der Werte Y &#39;mit den Werten von X, 4b. Lineare Regression der Handlung ergibt eine Steigung von 1.706 und einen Abschnitt von -0,536. Die Steigung entspricht Δ Säure H - Δ Säure H durchschnittl. Der Wert Δ Säure H avg ist bekannt, 330,5 kcal / mol, die durch den Satz von ausgewählten Referenz Säuren bestimmt wird. Der Wert der Gasphase Säure des Peptids wird dann aus der Steigung erhalten: Δ Säure H (A 3 CH) = 332,2 kcal / mol. </li></ol>

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Nichts zu offenbaren.

Die erfolgreiche Messung der Gasphase Säuregehalt eines Peptids weitgehend beruht auf der Auswahl geeigneter Referenz Säuren. Die ideale Nachschlagewerk Säuren sind strukturell ähnliche organische Verbindungen mit etablierten Gasphase Säurewerte. Die Referenz-Säuren sollten ähnliche Strukturen zueinander haben. Dadurch wird eine ähnliche Entropie Deprotonierung für jeden der Referenz-Säuren in dem Satz. Die Referenz-Säuren sollten Säurewerte nahe an denen der Peptide. Für kürzere Cystein enthaltenden Oligo...

Die Aciditäten Aminosäurereste gehören zu den wichtigsten thermochemischen Eigenschaften, die die Strukturen zu beeinflussen, die Reaktivität und die Faltungs-Entfaltungs-Prozesse von Proteinen 9,19. Einzelne Aminosäurereste zeigen oft unterschiedliche effektive Aciditäten je nach ihren Standorten in Proteinen. Insbesondere die Reste an den aktiven Zentren befinden zeigen oft deutlich gestört Aciditäten. Ein solches Beispiel ist der Cysteinrest mit Wohnsitz in den aktiven Zentren des Thioredoxin super-Familie von Enzymen 20,21. Das aktive Zentrum Cystein ist ungewöhnlich sauren im Vergleich zu denen in entfaltete Proteine ​​3-5. Es wurde vorgeschlagen, dass die Helix-Konformation kann einen wesentlichen Beitrag zur ungewöhnlichen Säure haben. Es gibt umfangreiche experimentelle Untersuchungen über die Säure-Base-Eigenschaften von Peptiden in Lösungen durchgeführt, insbesondere in wässrigen Lösungen 2,6-8. Die Ergebnisse wurden oft von Lösungsmitteleffekte kompliziert7. In der Tat sind die meisten der aktiven Stellen in Proteinen in der Nähe des inneren Bereichs in dem Lösungsmittel 9,10 Wirkungen minimiert befinden. Um intrinsische Säure-Base-Eigenschaften von Peptiden und Proteinen zu verstehen, ist es wichtig für die Durchführung der Untersuchungen in einer lösungsmittelfreien Umgebung. Hier stellen wir eine Massenspektrometrie-basierte Verfahren zur Bestimmung der Gasphase Säure. Der Ansatz wird als erweiterte Cooks kinetische Methode bezeichnet. Diese Methode wurde erfolgreich in einer Vielzahl von chemischen Systemen zur Bestimmung von verschiedenen thermochemischen Eigenschaften, wie z. B. der Gasphase Säure, die Protonen-Affinität, die Affinität für Metallionen, die Elektronenaffinität und der Ionisierungsenergie 11-15 angelegt, 22-26. Wir haben diese Methode, um die Gas-Phase Aciditäten einer Reihe von Oligo-Cystein und Cystein-Polyalanin Polyglycin Peptide 17,18,27 bestimmen angewendet. Diese Studien zeigen, dass die N-terminalen Cystein Peptides sind deutlich saurer als die entsprechenden C-terminalen diejenigen. Die hohe Acidität der ersteren sind wahrscheinlich auf die schraubenförmigen Konformationseffekte in dem das Thiolat-Anion stark durch die Wechselwirkung mit der Wendel Makro-Dipol stabilisiert wird. Aufgrund der nicht-flüchtige und thermisch instabil sind Peptide, die kinetische Methode ist es am praktischsten derzeit vorliegenden einigermaßen genaue Säure-Base-thermochemischen Mengen von Peptiden 28 zu erzeugen. Das allgemeine Schema und die Gleichung mit der kinetischen Verfahren zusammenhängen, sind in 1 gezeigt. Die Bestimmung der Gasphase Säure eines Peptids (AH) mit der Bildung einer Reihe von Protonen-gebundenen Clusteranionen [A • h • A i] ¯ (oder [A ¯ • H + • A ¯ i] ¯), in der Ionenquelle Region des Massenspektrometers, wobei A ¯ A ¯ i sind die deprotonierte Form des Peptids unddie Referenz-Säuren sind. Die Referenz-Säuren sind organische Verbindungen mit bekannten Gasphase Aciditäten. Die Säuren dienen sollten Strukturen einander ähnlich (jedoch nicht notwendigerweise ähnlich der des Peptids). Die Ähnlichkeit der Strukturen zwischen Referenz-Säuren stellt die Ähnlichkeit der Entropien Deprotonierung unter ihnen. Das Proton-gebundene Cluster Anionen Masse ausgewählt und collisionally aktiviert und anschließend mit dissoziierten Stoßfragmentierung (CID) Experimente, um die entsprechenden monomeren Anionen ergeben, A und A ¯ ¯ i, mit Geschwindigkeitskonstanten k und k i, jeweils in Abbildung 1a. Wenn sekundäre Fragmentierungen vernachlässigbar sind, die Fülle Verhältnis der CID-Fragment-Ionen, [A ¯] / [A i ¯], stellt ein ungefähres Maß für das Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten k / k i. Unter der Annahme, dass es keine umgekehrte aktivierendenIonensperren sowohl Dissoziationskanäle die CID Produkt Ion Verzweigungsverhältnisse, ln [A ¯] / [A i ¯], linear auf die Gasphasen-Acidität des Peptids (Δ Säure H) und diejenigen werden korreliert werden die Referenz-Säuren (Δ Säure H i), wie in 1b gezeigt. In dieser Gleichung Δ Säure H avg die durchschnittliche Gasphase Säuregehalt der Referenz-Säuren ist, Δ (Δ S) die Entropie Begriff (das kann als konstant angenommen werden, wenn die Referenz-Säuren sind strukturell einander ähnlich) ist, R die universelle Gaskonstante und T eff die effektive Temperatur des Systems. Die effektive Temperatur ist eine empirische Parameter ist, der mehrere experimentelle Variablen, einschließlich der Kollisionsenergie abhängt. Der Wert der Gasphase Säure wird erreicht, indem zwei Sätze von thermo-kinetische Diagramme bestimmt. Der erste Satz der OBenthaltenen durch Auftragung ln ([A ¯] / [A i ¯]) gegen Δ Säure H i - Δ Säure H avg, wie in Abbildung 4a gezeigt. Lineare Regression wird eine Reihe von geraden Linien mit den Pisten von X = 1 / RT eff und fängt von Y Ausbeute = - [Δ Säure H - Δ Säure H avg] / RT eff - Δ (Δ S) / R. Der zweite Satz von Flächen durch Auftragen der resultierenden fängt (Y) aus dem ersten Satz mit den entsprechenden geneigten Flächen (X), wie in 4b gezeigt ist. Lineare Regression erzeugt eine neue Linie mit einer Steigung von Δ Säure H - Δ Säure H avg und ein Abschnitt von Δ (Δ S) / R. Der Wert Δ H Säure wird dann aus der Steigung erhalten, und die Entropieterm, Δ (Δ S), erhält man ausder Schnittpunkt. Die Experimente werden unter Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer eine Schnittstelle mit einer Elektrospray-Ionisations (ESI)-Ionenquelle. Ein schematisches Diagramm des Massenspektrometers ist in Abbildung 2 dargestellt. Die CID Experimente Masse Auswahl der Protonen-bound-Anionen mit dem ersten Quadrupol-Einheit und es ihnen ermöglicht, um Kollisionen mit Argon-Atomen in der Kollision Kammer, die bei einem Druck von etwa 0,5 mTorr gehalten wird zugespielt Eingriff durchgeführt. Die Spaltprodukt Ionen Masse mit dem dritten Quadrupol-Gerät analysiert. Die CID-Spektren werden bei mehreren Kollisionsenergien mit dem m / z-Bereich breit genug, um alle möglichen sekundären Fragmente decken aufgezeichnet. Die CID Produkt Ionenintensitäten indem das Gerät in der gewählten Reaktionstemperatur Monitoring (SRM), in dem die Scan ausgewählten Produkt-Ionen fokussiert wird gemessen. Die CID Experimente werden an vier verschiedenen Kollisionsenergien durchgeführt, entsprechendCenter-of-mass Energien (E cm) von 1,0, 1,5, 2,0 und 2,5 eV. Die Mitte-der-Masse-Energie wird unter Verwendung der Gleichung: E = E Labor cm [m / (M + m)], wobei E Labor die Aufprallenergie im Laborsystem ist, m die Masse der Argon und M die Masse des Proton-gebundenen Cluster-Ionen. In diesem Artikel verwenden wir die Oligo-Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) als Vorbild Verbindung. Der C-Terminus amidiert ist und die Thiolgruppe (SH) des Cysteins wird die saure Website. Die Auswahl eines geeigneten Referenz Säuren ist von entscheidender Bedeutung für die erfolgreiche Messung der Gasphase Säure. Die ideale Nachschlagewerk Säuren sind strukturell ähnlich (miteinander) organische Verbindungen mit etablierten Gasphase Säurewerte. Die Säuren dienen sollte Säure Werte nahe, dass der Peptide. Für das Peptid A 3 CH, halogenierte sechs carbonsäurec Säuren werden als Referenz-Säuren gewählt. Die sechs Referenz Säuren sind Chloressigsäure (MCAH) Bromessigsäure (MBAH), Difluoressigsäure (DFAH), Dichloressigsäure (DCAH), dibromoacetic Säure (DBAH) und Trifluoressigsäure (TFAH). Zwei von ihnen, wird DFAH und MBAH, verwendet werden, um das Protokoll zu veranschaulichen.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>1200 L and 320 L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402923</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B56307</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Difluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>142859</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D54702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dibromoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>242357</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of the gas-phase acidities of oligopeptides

Aminosäurereste an verschiedenen Positionen in gefalteter Proteine ​​liegen häufig eine unterschiedliche Grade der Acidität. Zum Beispiel ist ein Cystein-Rest am oder nahe dem N-Terminus einer Wendel liegt oft saurer als das bei oder in der Nähe des C-Terminus 1-6. Obwohl umfangreiche experimentelle Untersuchungen über die Säure-Base-Eigenschaften von Peptiden wurden in der kondensierten Phase, insbesondere in wässrigen Lösungen 6-8 durchgeführt, werden die Ergebnisse oft durch Lösungsmitteleffekte 7 kompliziert. In der Tat sind die meisten der aktiven Stellen in Proteinen in der Nähe des inneren Bereichs, wo Lösungsmittel-Effekte wurden 9,10 haben minimiert wird. Um intrinsische Säure-Base-Eigenschaften von Peptiden und Proteinen zu verstehen, ist es wichtig, die Studien in einer lösungsmittelfreien Umgebung durchzuführen. Wir präsentieren eine Methode, um die Aciditäten Oligopeptide in der Gasphase zu messen. Wir verwenden eine Cystein enthaltenden Oligo-, Ala 3 CysNH <sub&gt; 2 (A 3 CH), als Modell Verbindung. Die Messungen werden auf dem gut etablierten erweiterten Cooks kinetische Methode (Abbildung 1) 11-16 bezogen. Die Experimente werden unter Verwendung einer Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer eine Schnittstelle mit einer Elektrospray-Ionisations (ESI)-Ionenquelle (Abbildung 2). Für jedes Peptid Beispiel werden mehrere Referenz Säuren. Die Referenz-Säuren sind strukturell ähnliche organische Verbindungen mit bekannten Gasphase Aciditäten. Eine Lösung der Mischung aus dem Peptid und einem Referenz Säure in das Massenspektrometer eingeführt wird, und ein Gas-Phasen Proton-gebundene anionische Gruppe von Peptid-Referenz Säure gebildet wird. Das Proton-gebundene Cluster Masse isoliert und anschließend über Stoßfragmentierung (CID) Experimente fragmentiert. Die entstehenden Fragmentionen Häufigkeiten werden analysiert unter Verwendung einer Beziehung zwischen der Acidität und Clusterion Dissoziationskinetik. Das Gasphasen-Acidität des Peptids wird dann obtainiert durch lineare Regression der thermo-kinetischen Grundstücke 17,18. Das Verfahren kann auf eine Vielzahl von molekularen Systemen, einschließlich organischer Verbindungen, Aminosäuren und deren Derivate, Oligonukleotide und Oligopeptide eingesetzt werden. Durch den Vergleich der Gasphase Acidität experimentell mit den Werten für verschiedene Konformere berechnet gemessen wird, kann Auswirkungen auf die Konformation Acidität ausgewertet werden.

<ol><li> Die CID Bracketing Experimente liefern Informationen über die relativen Acidität des Peptids im Vergleich zu den ausgewählten Referenz-Säuren. Zwei repräsentative CID-Spektren des Peptids (A 3 CH) mit zwei Referenz-Säuren, DFAH und MBAH, sind in Abbildung 3 dargestellt. In Fig. 3a ist der Ionenhäufigkeit (Peakhöhe) des Peptid-Ion ist schwächer als die des DFA ¯ und in 3b ist die Ionenhäufigkeit des Peptids Ionen stärker als die des MBA ¯. Die beiden Spektren zei...

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Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Die Bestimmung der Gasphase Acidität von Cystein enthaltenden Oligopeptide beschrieben. Die Experimente werden unter Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer. Die relativen Aciditäten der Peptide werden mit Stoßfragmentierung Experimente, und die quantitative Aciditäten werden unter Verwendung der erweiterten Cooks kinetische Methode.

Bestimmung der Gas-Phase Aciditäten von Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

11.0K Aufrufe.  University of the Pacific. Die Bestimmung der Gasphase Acidität von Cystein enthaltenden Oligopeptide beschrieben. Die Experimente werden unter Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer. Die relativen Aciditäten der Peptide werden mit Stoßfragmentierung Experimente, und die quantitative Aciditäten werden unter Verwendung der erweiterten Cooks kinetische Methode.