Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Peptidsynthesefeld zu beantworten, wie z. B. die Synthese von Disulfidreichen Peptiden und die Bestimmung des entsprechenden Disulfidbrückenmusters. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die selektive Synthese verschiedener Disulfid-Bondend-Peptid-Isomer und deren anschließende chemische und strukturelle Charakterisierung ermöglicht. Im Allgemeinen Personen neu zu dieser Methode wird kämpfen, weil jedes Disulfid reiches Peptid verhält sich anders.
Synthese und Analyse müssen möglicherweise teilweise für einzelne Peptid oder Proteine optimiert werden. Übertragen Sie die im Textprotokoll aufgeführten Reagenzien auf die entsprechenden Gefäße und legen Sie sie in die entsprechenden Schläger des Festphasen-Peptid-Synthesizers. Dann fügen Sie 100 Milligramm Trockenharz zu den Reaktionssäulen hinzu und legen Sie sie in den Schläger des Synthesizers.
Starten Sie die Volumenphasen-Peptidsynthese, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem die Synthese abgeschlossen ist, lyophilisiert das Harz über Nacht. Nun das Peptid aus dem Harz spalten und einen tiefen Schutz der Seitenketten durchführen.
Dazu das getrocknete Harz in einem 12-Milliliter-Rohr kombinieren und auf Eis auf null Grad Celsius abkühlen. Zuerst 150 Mikroliter einer Schnitzeljagdmischung hinzufügen und dann einen Milliliter 95% Trifluoressigsäure pro 100 Milligramm Harz hinzufügen. Lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur drei Stunden lang sanft schütteln.
Nun filtern Sie die Mischung durch eine Glasfrikte. Das Filtrat in Schläuchen sammeln, die einzeln mit eiskaltem Diethylether bei einem Milliliter Dekolletégemisch pro acht bis 10 Milliliter Diethylether gefüllt sind. Das Peptid scheide als weißer Feststoff aus.
Nach dem Spülen und Zentrieren der Röhrchen, wie im Textprotokoll beschrieben, die Peptide einfrieren. Um den linearen Vorläufer mit halbpräparativer Chromatographie zu reinigen, fügen Sie etwa 70 Milligramm des rohen Peptids zu einem 15-Milliliter-Röhrchen hinzu. Dann lösen Sie das rohe Peptid in 0,1%TFA und Eins-zu-eins Acetonitril zu Wasser.
Trennen Sie die Peptidmischung mit einem Gradienten von Null bis 50%Eluent B über 120 Minuten bei einer Durchflussrate von 10 Milliliterpro Minute. Sammeln Sie die Brüche in einzelnen Röhren, wie sie erscheinen, und bereiten Sie ausgewählte Brüche für die Massenspektrometrie und HPLC-Analyse vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Fraktionen einfrieren und die Peer-Fraktionen kombinieren.
Starten Sie die selektive Bildung von Disulfidbindungen, indem Sie die erste Oxidation durchführen. Um dies zu tun, lösen Sie 15 Milligramm des gefriergetrockneten linearen Peptids in 105 Milliliter eines Isopropanol-Wassergemischs auf. Lassen Sie die Mischung unter den Grundbedingungen 12 bis 48 Stunden rühren.
Das stufenweise Oxidationsverfahren ist sehr kritisch. Reaktionssteuerungen werden in allen drei Oxidationsschritten durchgeführt, um eine individuelle Disulfidreiche Bildung zu gewährleisten. Die dritte Oxidation ist die wichtigste, da Disulfid-Rührei auftreten kann, wenn die optimale Reaktionszeit überschritten wird.
Führen Sie nun die zweite Oxidation durch. 15 Milligramm des gefriergetrockneten Peptids in 105 Milliliter n eines Isopropanolwassers, einem molaren Salzsäuregemisch, auflösen. 158 Mikroliter einer 0,1 Molarenjodlösung in Methanol in die Lösung geben.
Rühren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur, bis die Oxidation abgeschlossen ist. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie 79 Mikroliter einer molaren Ascorbinsäure in Wasser hinzufügen. Schließlich die dritte Oxidation durchführen.
15 Milligramm des gefriergetrockneten Peptids in 5,5 Milliliter TFA, das eine Schnitzelmischung enthält, auflösen. Das Peptid in Röhrchen mit kaltem Diethylether mit einem Milliliter Reaktionslösung pro acht bis zehn Milliliter Diethylether ausfälten. Zur Durchführung der Peptidreinigung bei 15 Milligramm des gefriergetrockneten Rohprodukts zu einem 15-Milliliter-Rohr.
Lösen Sie das Rohprodukt im Volumen der HPLC-Probenschleife mit einer Mischung aus 0,1%TFA und eins zu eins Acetonitril zu Wasser auf. Nach dem Wirbeln bis zur vollständigen Auflösung zentrieren Sie die Lösung von einer Minute bei 3400-fachG.Zeichnen Sie das 3,6-Milliliter-Gemisch in einer 5-Milliliter-Spritze auf und injizieren Sie die Probe ohne Luftblasen in die Injektionsschleife. Starten Sie die Injektion in das HPLC-System.
Reinigen Sie die Peptidmischung mit einem Gradienten von Null bis 50%Eluent B über 120 Minuten bei einer Durchflussrate von 10 Milliliterpro Minute. Sammeln Sie die Brüche in einzelnen Rohren, wie sie erscheinen. Bereiten Sie nach Abschluss des Durchlaufs ausgewählte Brüche für die MS- und HPLC-Analyse vor, wie im Text beschrieben.
Alle Fraktionen einfrieren und bei minus 20 Grad Celsius lagern. Um analytische HPLC durchzuführen, übertragen Sie Proben der Peptidfraktionen oder Reaktionssteuerungen in eine HPLC-Durchstechflasche und lösen Sie sie in der Mischung von 0,1%TFA in eins zu eins Acetonitril in Wasser. Legen Sie die HPLC-Durchstechflasche in den Auto-Sampler der analytischen Rückphase HPLC eingestellt, um 250 Mikroliter jeder Probe zu injizieren.
Verwenden Sie ein Gradientenelutionssystem von 0,1%TFA in Wasser als Eluent A in 0,1%TFA in Acetonitrile als Eluent B.Analysieren Sie das Peptid mit einem Gradienten von 10% bis 40%Eluent B über 30 Minuten bei einer Durchflussrate von 1,0 Milliliter pro Minute. Zur Durchführung der Aminosäureanalyse 100 Mikrogramm des reinen Peptids in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen und das Pulver in 200 Mikrolitern von sechs Mol-HCL auflösen. Nach der Übertragung der Lösung auf eine Glasampulle, schließen Sie die Ampulle, indem Sie den Hals mit einer Bunsenbrennerflamme erhitzen.
Dann legen Sie ein Glasrohr, das die Ampulle hält in einem Heizblock für 24 Stunden bei 110 Grad Celsius für die Hydrolyse. Nach 24 Stunden öffnen Sie die Ampulle und übertragen Sie die Lösung in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Lösung für sechs Stunden bei sechzig Grad Celsius und 210 Mal G in einem Rotationsvakuumkonzentrator.
Lösen Sie dann das hydrolysierte Produkt in 192 Mikroliter des abgetasteten Verdünnungspuffers auf und übertragen sie in einen Mikrozentrifugalfilter. Nach zentrifugieren der Probe für eine Minute bei 2300 mal G, übertragen Sie 100 Mikroliter des Filtrats in ein Probenröhrchen der Aminosäureanalyse. Legen Sie die Röhre in den Aminosäureanalysator und starten Sie die Analyse.
Während dieses früheren Reduktionsprotokolls ist es entscheidend, mehrere Reaktionskontrollen durchzuführen, um zweimal oder viermal kappa mido methylierte Arten zu erhalten, die für die nachfolgende Disulfidanalyse mittels Massenspektrometrie unerlässlich sind. Lösen Sie zunächst 600 Mikrogramm des reinen Peptids in 1,2 Millilitern 0,05 Molar-Citratpuffer mit TCEP auf. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur und nehmen Sie mehrere 100 Mikroliter Reaktionskontrollproben von null bis 30 Minuten.
Mischen Sie die Proben in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit 300 Mikroliter Alkylierungspuffer, um die Reaktion zu stoppen und die Carbonylmethylierung der freien Thiolgruppen durchzuführen. Stoppen Sie die Reaktion nach fünf Minuten, indem Sie 100 Mikroliter 10%TFA und Wasser hinzufügen und die Proben auf Trockeneis lagern. Führen Sie nun HPLC für die Samples aus, wie im Textprotokoll beschrieben.
Übertragen Sie eine kleine Menge jeder gesammelten Fraktion auf ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zur MS/MS-Analyse der oxidierten Formen. Lösen Sie das verbleibende Peptid in 0,1%TFA in Wasser auf und fügen Sie ein entsprechendes Volumen über eine 100 Millimolar TCEP-Lösung hinzu, um eine endgültige TCEP-Konzentration von 10 Millimolar zu erhalten. An dieser Stelle kann die selektive Cysteinalkylierung mittels Peptidsequenzierung überprüft werden.
Mit den beiden Peptiden in der Mitte ist eine Bestimmung des Disulfidbrückenmusters möglich. Die NMR-Analyse der verschiedenen Isomere wird durchgeführt, um die einzelnen Peptidstrukturen aufzudecken. Gezeigt werden die 20 Strukturen mit den niedrigsten Energien sowie die Disulfidkonnektivität der verschiedenen Isomere.
Insbesondere ist eine Kombination aus umgekehrter HPLC MS/MS-Fragmentierung und NMR-Analyse erforderlich, um die Disulfidkonnektivität eindeutig zu identifizieren. Der Vergleich des mittleren quadratischen Abweichungswertes der Wurzel stellte klar, dass ein starres Peptid meist zu einer besser gelösten NMR-Struktur führt. Dieses Video sollte Ihnen ein Beispiel geben, wie Sie Peptide selektiv mit einem gewünschten Disulfidbindungsmuster synthetisieren können.
Es zeigt auch die Möglichkeit, die korrekte Disulfidkonnektivität über zarte Massenspektrometrie zu überprüfen und eine dreidimensionale Struktur mittels NMR-Spektroskopie zu erhalten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Peptidsynthese den Weg, um die Bedeutung von Disulfidbindungsmustern für die dreidimensionale Struktur und damit die Aktivität solcher Peptidisomeren zu erforschen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Aktivität ASAS durchgeführt werden, um Einblicke in Strukturaktivitätsbeziehungen verschiedener Peptid-Isomere am spezifischen biologischen Ziel zu erhalten.
Obwohl diese Methode Einblick in die Synthese und Analyse von Conotoxinen geben kann, kann sie auch auf andere Disulfidbrückenpeptide und Proteine wie die Fenzen, disulfidreiche Tiergifte und andere mehrfache Cystein enthaltende Moleküle angewendet werden.
