Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) Gewährung DA030396 unterstützt. Dank an die Mitglieder des Drenan Labor für hilfreiche Diskussionen und Kritik des Manuskripts. Besonderer Dank geht an Mi Ran Kim für technische Hilfe und Jonathan Thomas Ting um Rat bezüglich erwachsenen Maus Hirnschnitten.

Ein. Herstellung von Lösungen für Brain Scheibe Vorbereitung und Elektrophysiologie <ol><li> Lösungen für die Herstellung von Hirnschnitten wurden bisher 3, 4 beschrieben. Planen N-Methyl-D-glucamin (NMDG)-basierten Schneiden und Recovery-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mM): 93 N-Methyl-D-Glucamin, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 Glucose, 5 Na + Ascorbat, 2 Thioharnstoff, 3 Na + Pyruvat, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 • 2H 2 O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit NMDG. PH-Wert auf 7,3-7,4 mit 10 N HCl. <ol class="lalpha"><li> Lösen MgSO 4 • 7H 2 O und CaCl 2 • 2H 2 O in Millipore Wasser zu 2 M Stammlösungen von jedem machen. </li><li> Abzuwiegen anderen Komponenten in der angegebenen Reihenfolge und in eine teilweise gefüllte Messkolben mit Millipore-Wasser unter Rühren zu lösen. Sobald alles zugegeben, füllenMesskolben mit Millipore-Wasser. </li><li> Messen Sie den pH-Wert und die Einstellung mit 10 N HCl. </li><li> Messen Sie die Osmolarität und stellen Sie mit NMDG wenn nötig. </li></ol></li><li> Planen HEPES Halten künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF) der folgenden Zusammensetzung (in mM): 92 NaCl, 2.5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20 HEPES, 25 Glucose, 5 Na + Ascorbat, 2 Thioharnstoff, 3 Na + Pyruvat, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit Saccharose. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 mit 1 N HCl oder NaOH. <ol class="lalpha"><li> Abzuwiegen Komponenten in der angegebenen Reihenfolge und in eine teilweise gefüllte Messkolben mit Millipore-Wasser unter Rühren zu lösen. Sobald alles zugegeben, füllen Messkolben mit Millipore-Wasser. </li><li> Messung des pH-Wertes und Einstellen mit NaOH oder HCl, wenn nötig. </li><li> Messen Sie die Osmolarität und stellen mit Saccharose, wenn nötig. </li></ol></li><li> Standardlösungen aCSF Aufzeichnungs-Lösung folgender Zusammensetzung (in mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12,5 Glucose, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Passen Sie auf 300-310 mOsm mit Saccharose. PH-Wert auf 7,3 bis 7,4 mit 1 N HCl oder NaOH. </li></ol> 2. Vorbereitung der akuten Hirnschnitten <ol><li> Gehirnscheibe Schneiden und Wiederherstellung erfolgen wie zuvor 3, 4 beschrieben. Bubble zwei Kristall Gerichte mit NMDG Recovery-Lösung mit 95% Sauerstoff / 5% CO 2-Gas (Carbogen), eine Schüssel auf dem Eis, die andere bei 33 ° C gefüllt </li><li> Blase ein Kristall Schale mit HEPES Halten aCSF mit Carbogen bei Raumtemperatur gefüllt. </li><li> Anesthetize erwachsenen Maus (im Alter von 2 bis 12 Monaten) mit Na + Pentobarbital (200 mg / kg, ip). Fahren Sie mit dem Vorgang, wenn das Tier hat keine Antwort auf eine toe-Prise. </li><li> Falls erforderlich, einen Schwanz Gewebeprobe für eine spätere GenotypIng. des Tieres. </li><li> Öffnen Sie die Brusthöhle, Setzen Sie das Herz, und klemmen Sie die absteigende Aorta. Aufschlitzen den rechten Vorhof. </li><li> Transkardial perfundieren Tier mit 5-10 ml 0-4 ° C NMDG-Recovery-Lösung. </li><li> Enthaupten Tier, entfernen Sie das Gehirn und legen Sie es in 4 ° C NMDG-Recovery-Lösung für 1 min. </li><li> Auf einer eisgekühlten Metallplatte, schneiden das Gehirn in der gewünschten Ausrichtung (koronal, parasagittal, horizontal, etc.), um den Bereich in der Nähe sind. </li><li> Bringen Sie das Gehirn Block mit Sekundenkleber auf die trockene Bühne Oberfläche eines vibrierenden Allesschneider (DSK-Zero 1; Dosaka), tauchen das Gehirn Block in 4 ° C NMDG-Recovery-Lösung, und kontinuierlich bubble die Lösung mit Carbogen. </li><li> Angeschnitten des Gehirns Bereich von Interesse. Scheibendicke beträgt 200-400 um, abhängig von der spezifischen Gehirn interessierenden Bereich, tierische Alter und Experiment durchzuführen. </li><li> Unmittelbar nach dem Schneiden carbogenated inkubieren gewünschten Scheiben, 33 ° C NMDG-Recovery-Löauf genau 12 min, dann carbogenated, Raumtemperatur HEPES hält Lösung für einen anfänglichen Zeitraum von 60 min zu übertragen. Nach dieser 60 min Inkubation kann Scheiben für Aufnahmen verwendet werden. Scheiben werden in HEPES halten Lösung den ganzen Tag, bis sie für die Aufnahme verwendet werden beibehalten. </li></ol> 3. Patch Clamp Aufnahme von Neuronen im Gehirn Slices <ol><li> Ziehen Sie einen Standard-Patch-Mikropipette mit einer programmierbaren Flaming-Brown Puller (Sutter P-97 oder gleichwertig vertikale puller). Pipetten, die optimal für Giga-Ohm Dichtung Formation sind typischerweise einen Widerstand von 4-6 MOhm </li><li> Übertragen einer Scheibe zur Aufnahme Kammer (RC-27L; Warner Instruments) auf der Stufe eines aufrechten Mikroskop (Nikon FN-1). Kontinuierlich superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) die Scheibe mit carbogenated, Standard-Aufnahme aCSF erhitzt und bei 32 ° C gehalten Alternativ kann Scheiben bei Raumtemperatur gehalten werden. </li><li> Suchen und in der Mitte des Gehirns Bereich von Interesse mita 10X Luftobjektiv (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm). </li><li> Visualisieren einzelnen Neuronen mit einem 40X Nah-Infrarot-(IR-) Wasser Immersionsobjektiv (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) mit IR-Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Optik und einem High-Speed-nahen Infrarot charged coupled device (CCD) Videokamera (Hamamatsu C-7500). Unter IR-DIC Beobachtung, weisen gesunde Neuronen eine glatte, hellgraue Plasmamembran. </li><li> Füllen Sie eine Mikropipette mit einem geeigneten intrazellulären Recording-Lösung. Für die meisten Anwendungen, verwenden wir die folgende Lösung (in mM): 135 Kaliumgluconat, 5 EGTA, 0,5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP und 0,1 (pH-Wert auf 7,25 mit Tris-Base, Osmolarität eingestellt eingestellt auf 290 mOsm mit Saccharose). Stellen Sie eine whole-cell-Aufnahme von einer visualisierten Neurons. </li></ol> 4. Lokale Anwendung von Medikamenten zu Neuronen in Scheiben <ol><li> Ziehen Sie ein Standard-Patch-Clamp-Mikropipette wie oben beschrieben. Miteine Pipette Abziehvorrichtung wie eine Sutter P-97, die zwei identische &quot;Schwester&quot; Spitzen aus dem gleichen Stück Glas produziert, ist von Vorteil, wenn multiple drug Lösungen auf derselben Zelle verwendet werden sollen. Tip Größen, die einen Widerstand von ~ 5 MW haben würden, wenn sie mit der intrazellulären oben beschriebenen Lösung gefüllt wurden, sind optimal. </li><li> Hinterfüllung die Mikropipette mit einer Lösung des Wirkstoffs in carbogenated, Standard-Aufzeichnungs aCSF verdünnt. Richten Sie die Spitze nach unten, und Flick die Droge gefüllte Mikropipette, um Luftblasen in der Spalte der Lösung aufgefangen entfernen. </li><li> Montieren das Medikament gefüllte Mikropipette in einem Pipettenhalter mit Schlauch an einem geeigneten Druck Lastausstoßsystem wie eine Picospritzer III (General Valve Co.) verbunden ist. Der Pipettenhalter sollte auf einem Mikromanipulator mit der gleichen Auflösung montiert werden als Manipulatoren allgemein für Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet (z. B. Sutter MP-285). Außerdem sollte der Manipulator für diagonale Bewegungen in und aus der Scheibe zu ermöglichen. Mannmanuell auswerfen Druck 3 bis 4 Mal in die Mikropipette, um den Aufbau ausreichender Druck hinter der Säule der Flüssigkeit. </li><li> Mit den Mikromanipulator Kontrollen senken das Medikament Pipette in der Scheibe, während die Visualisierung der Spitze unter IR-DIC-Optik. Idealerweise sollte ein visuell zu identifizieren und in der Mitte ein Neuron aus aufgezeichnet werden, durch Positionieren des Medikaments Pipette nahe der Zelle vor dem Absenken des Aufzeichnungs Mikropipette in die Scheibe folgt. Positionieren der Pipette kann Medikaments Bewegung von Gewebe in der Nähe der Zelle, die die aufgezeichneten Aufzeichnungs stören könnte, wenn das Medikament Pipette in die Position nach Festlegung eines Gigaohm Dichtung bewegt verursachen. </li><li> Verwendung von IR-Video, das Medikament zu positionieren Mikropipette an der oberen Fläche des Gewebeschnitts. Ausführen ein Druck Ausstoßen und Monitor 1) der Umgebung der Spitze für eine Bewegung von Trümmern im Zusammenhang mit dem Ausstoßen, und 2) die Mikropipettenspitze auf Anzeichen, daß die Spitze verstopft oder blockiert. Wenn die Spitze blockiert / verstopft, zurückziehen pipette und ersetzen sie durch eine neue. </li><li> Nähern das aufgezeichnete Zelle diagonal von oben der Scheibe derart, dass, wenn in der Endposition ist die Spitze des Medikaments gefüllten Pipette 1) in derselben Fokalebene (oder leicht darunter) als aufgezeichnete Zelle und der Spitze der Aufzeichnungselektrode und 2) 10 bis 40 um aus dem aufgenommenen Zelle. Wenn das Medikament gefüllte Pipettenspitze ist oberhalb des aufgezeichneten Zelle könnte die Kraft von dem Druck Ausstoßen stören die Gigaohm Dichtung. </li><li> Notieren Sie die gewünschte zelluläre Reaktion, während die Zelle in Voltage-Clamp-Modus oder Stromzange Modus. Wir routinemäßig aufzeichnen Acetylcholin und / oder Nikotin-induzierte zelluläre Ströme, während Neuronen im Voltage-Clamp-Modus. Obwohl Druck Ausstoßen manuell ausgelöst werden kann, wenn unter Verwendung eines Picospritzer III, für mehr reproduzierbare Ergebnisse empfiehlt es sich, den Druck über das Ausstoßen Erfassungssystem (Axon Digidata 1440 und pClamp 10.3) mit einem digitalen TTL-Impuls auszulösen. </li></ol> 5. RegelungDie Drug-gefüllte Mikropipette mit einem piezoelektrischen Übersetzer <ol><li> Wenn möglich, den Wirkstoff gefüllten Pipettenhalter um ein eindimensionales piezoelektrischen Übersetzer (zB Piezojena PA-100 oder Burleigh PZM-150), die in der Lage zur Annahme eines analogen Spannungseingang (wiederum aus der Übernahme-System), welches dann ist befestigt auf der hochpräzisen Mikromanipulator (Sutter MP-285). Piezoelektrischer Übersetzer ist nützlich, da die Bewegung des Medikaments gefüllten Pipette in die und aus der Scheibe, einschließlich des Zeitpunkts und der Geschwindigkeit der Eingangs / Ausgangs, leichter beherrscht werden kann, und wiedergegeben von Experiment zu Experiment. Bei der Untersuchung von nAChR, die desensibilisierende Wirkung von Nikotin Leckage aus dem Arzneimittel gefüllten Pipette, sollten sie je vorkommen, werden minimiert, wenn die Pipette wird nur in der Nähe der Zelle mit einem piezoelektrischen Übersetzer verschoben auf den Augenblick der Druck Ausstoßen. </li><li> Mit dem manuell gesteuerten Potentiometer auf dem piezoelektrischen Spannungsregelverstärker, wählen Sie die Spannungum ihren maximalen Wert. </li><li> Mit dem Mikromanipulator, Position der Droge gefüllte Pipette in der Scheibe, wo die Pipette seinen Inhalt auf die aufgezeichneten Zelle wird ausgeworfen, und Einfahren der Pipette durch manuelle Reduzierung der Spannung auf Null auf dem piezoelektrischen Spannungsregelverstärker. </li><li> Verwendung eines analogen Ausgangssignals von dem Aufzeichnungs-Erfassungssystem, bewegen das Medikament gefüllten Pipette in das Segment über einen Zeitraum von 250 msec beginnend 300 msec bevor der Druck Ausstoßen TTL-Impuls auftritt. Einfahren der Pipette über einen Zeitraum von 250 msec, 50 msec beginnend nach der TTL-Impuls endet. </li></ol>

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Das Verfahren in diesem Papier ist weitgehend nützlich für die Untersuchung Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Hirnschnitt Vorbereitungen. Es gibt jedoch eine Reihe von Faktoren wesentlich beeinflussen die Qualität und Reproduzierbarkeit der experimentellen Daten, die sich aus der Verwendung dieser Methode. Beispielsweise sind hervorgerufene Ströme sehr empfindlich auf den Durchmesser der Spitze des Arzneimittels gefüllten Pipette. Kleine Tipps werden Schwierigkeiten mit Ausstoßen der Arzneimittellösung...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Name des Reagenz</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-Methyl-D-glucamin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaH<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaHCO<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Ascorbat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thioharnstoff</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pyruvat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgSO<sub&gt; 4</sub&gt; • 7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CaCl<sub&gt; 2</sub&gt; • 2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pentobarbital</td&gt;<td&gt; Vortech Pharmaceuticals</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kaliumgluconat</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mg-ATP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DSK-Zero 1 Vibrations-Allesschneider</td&gt;<td&gt; Ted Pella, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RC-27 Recording Kammer</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344B Perfusion Heizungsregler</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SH-27B Lösung Heizer</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nikon FN-1</td&gt;<td&gt; Nikon</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 CCD Video Kamera</td&gt;<td&gt; Hamamatsu</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt; General Valve Co.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285 Micromanipulator</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100 Piezo-Übersetzer</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40 Piezoverstärker</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices

Tabakkonsum führt zu zahlreichen gesundheitlichen Problemen wie Krebs, Herzkrankheiten, Emphysem und Schlaganfall. Sucht nach Zigarettenrauchen ist eine weit verbreitete neuropsychiatrische Erkrankung, die von den biophysikalischen und zellulären Wirkungen von Nikotin auf Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren (nAChR) im gesamten zentralen Nervensystem beruht. Das Verständnis der verschiedenen nAChR Subtypen, in Hirnregionen, die für Nikotinsucht existiert ist eine wichtige Priorität. Experimente, die Elektrophysiologie Techniken wie whole-cell Patch-Clamp-oder Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Aufnahmen verwenden, sind für die pharmakologische Charakterisierung von nAChRs von Interesse nützlich. Exprimieren nAChRs, wie Säuger Gewebekulturzellen oder Xenopus laevis Oozyten sind galvanisch getrennt und können daher leicht studiert mit den Mitteln der modernen Pharmakologie. Große Fortschritte wurden gemacht mit diesen Techniken, insbesondere wenn die Target-Rezeptor bereits bekannt wurdend ektopische Expression wurde problemlos erreicht. Oft ist es jedoch notwendig, um nAChRs in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren: in Neuronen innerhalb Hirnschnitten akut vom Labor Mäusen oder Ratten geerntet. Beispielsweise exprimieren mice &quot;hypersensitiven&quot; nAChR-Untereinheiten wie α4 L9&#39;A Mäusen 1 und α6 L9&#39;S Mäusen 2, zur eindeutigen Identifizierung der Neuronen auf ihre funktionelle Expression eines spezifischen nAChR-Untereinheit basierend ermöglichen. Obwohl whole-cell Patch Clamp Messungen von Neuronen in Hirnschnitten wird routinemäßig durch den Fachmann Elektrophysiologen getan, ist es eine Herausforderung vor Ort gelten Drogen wie Acetylcholin oder Nikotin auf die aufgezeichneten Zelle innerhalb eines Hirnschnitt. Verdünnung der Wirkstoffe in die Superfusat (Badapplikation) nicht schnell reversible und U-Rohr-Systeme sind nicht leicht angepasst, um mit Hirnschnitten arbeiten. In diesem Papier beschreiben wir ein Verfahren zur schnellen Anwendung nAChR-aktivierende Medikamente Neuronen im erwachsenen m erfasstOuse Hirnschnitten. Standard Ganzzellableitungen aus Neuronen in Scheiben hergestellt, und ein zweites Mikropipette mit einem Medikament gefüllt ist von Interesse in Position in der Nähe der Zelle aufgenommen manövriert. Eine Injektion von Druckluft oder inerten Stickstoff in das Medikament gefüllten Pipette entsteht eine kleine Menge an Arzneimittel Lösung aus der Pipette auf die aufgezeichnete Zelle ausgestoßen werden. Mit dieser Methode sind nAChR-vermittelten Ströme können mit Millisekunden-Genauigkeit gelöst werden. Medikamentenapplikation mal leicht variiert werden, und das Arzneimittel gefüllten Pipette kann zurückgezogenen und mit einer neuen Pipette ersetzt werden, so dass für Konzentrations-Wirkungs-Kurven für ein einziges Neuron geschaffen werden. Obwohl im Rahmen der nAChR Neurobiologie beschrieben wurde, sollte diese Technik nützlich sein für die Untersuchung vieler Arten von Liganden-gesteuerte Ionenkanäle oder Rezeptoren im Gehirn Neuronen von Scheiben.

In unseren Experimenten haben wir routinemäßig von Dopamin (DA)-produzierenden Neuronen des ventralen Tegmentum (VTA) und der Substantia nigra pars compacta (SNC) aufzuzeichnen. Im Spannungs-Clamp-Modus wird Druckbeaufschlagung von Acetylcholin oder Nikotin an diese Zellen typischerweise in einer schnellen, einwärts Kationenstrom die Spitze erreicht innerhalb von 100 bis 200 ms (Fig. 1A-B) führen. Abklingen des Stroms wird weitgehend durch die Diffusion des Arzneimittels aus dem Wirkort diktiert, un...

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Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

In diesem Papier beschreiben wir eine nützliche Methode, um Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Neuronen akut isolierten Hirnschnitten studieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Arzneimittels, gefüllte Mikropipette zur lokalen Anwendung von Medikamenten, um unter Verwendung von Standard aufgezeichnet Neuronen Patch-Clamp-Techniken.

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

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JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Cholinergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

19.2K Aufrufe.  Purdue University. In diesem Papier beschreiben wir eine nützliche Methode, um Liganden-gesteuerte Ionenkanäle Funktion in Neuronen akut isolierten Hirnschnitten studieren. Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung eines Arzneimittels, gefüllte Mikropipette zur lokalen Anwendung von Medikamenten, um unter Verwendung von Standard aufgezeichnet Neuronen Patch-Clamp-Techniken.

Serie: Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2. Consequently, investigation of structural details of the interaction between 5-HT2A and mGlu2 affecting schizophrenia-related behaviors represents a powerful translational tool. As previously shown, the head-twitch response (HTR) in mice is elicited by hallucinogenic drugs and this behavioral response is absent in 5-HT2A knockout (KO) mice3,4. Additionally, by conditionally expressing the 5-HT2A receptor only in cortex, it was demonstrated that 5-HT2A receptor-dependent signaling pathways on cortical pyramidal neurons are sufficient to elicit head-twitch behavior in response to hallucinogenic drugs3. Finally, it has been shown that the head-twitch behavioral response induced by the hallucinogens DOI and lysergic acid diethylamide (LSD) is significantly decreased in mGlu2-KO mice5. These findings suggest that mGlu2 is at least in part necessary for the 5-HT2A receptor-dependent psychosis-like behavioral effects induced by LSD-like drugs. However, this does not provide evidence as to whether the 5-HT2A-mGlu2 receptor complex is necessary for this behavioral phenotype. To address this question, herpes simplex virus (HSV) constructs to express either mGlu2 or mGlu2&#916;TM4N (mGlu2/mGlu3 chimeric construct that does not form the 5-HT2A-mGlu2 receptor complex) in the frontal cortex of mGlu2-KO mice were used to examine whether this GPCR heteromeric complex is needed for the behavioral effects induced by LSD-like drugs6.

This article describes how to inject viral vectors into the mouse frontal cortex to test behavioral assays that require GPCR heteromeric formation.

HSV-Mediated Transgene Expression von chimären Konstrukten Behavioral Funktion von GPCR Heteromeren bei Mäusen zu studieren

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.

Whole-Cell Ströme induziert durch Blätterteig Anwendung von GABA im Gehirnscheiben

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with subcellular location within cells where this function is carried out. To study the subcellular location of nicotinic ACh receptors (nAChRs) in native brain tissue, an optical method was developed for precise release of nicotine at discrete locations near neuronal membranes during electrophysiological recordings. Patch-clamped neurons in brain slices are filled with dye to visualize their morphology during 2-photon laser scanning microscopy, and nicotine uncaging is executed with a light flash by focusing a 405 nm laser beam near one or more cellular membranes. Cellular current deflections are measured, and a high-resolution three-dimensional (3D) image of the recorded neuron is made to allow reconciliation of nAChR responses with cellular morphology. This method allows for detailed analysis of nAChR functional distribution in complex tissue preparations, promising to enhance the understanding of cholinergic neurotransmission.

This article presents a method for studying nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in mouse brain slices by nicotine uncaging. When coupled with simultaneous patch clamp recording and 2-photon laser scanning microscopy, nicotine uncaging connects nicotinic receptor function with cellular morphology, providing a deeper understanding of cholinergic neurobiology.

Sondieren Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Gehirnscheiben per Laser Flash Photolyse von Photoactivatable Nikotin

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Studium der Funktion des Gehirns bei Kindern mit Magnetoenzephalographie

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Chronische Implantation des gesamten kortikalen Electrocorticographic Arrays in der Weißbüschelaffe

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Lokale Anwendung von Medikamenten zur nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Funktion in Maus Hirnschnitten Studie

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