Wir danken Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder in JCT und LM-S Laboratorien für die Entwicklung und Verbesserung der Arenavirus reversen Genetik Techniken und Plasmide. Wir danken auch Snezhana Dimitrova für technische Unterstützung. Der monoklonale Antikörper, der gegen JUNV NP (SA02-BG12) wurde von BEI Resources (NIAID Biodefense and Emerging Infektionen Research Resources Repository) erhalten. BYHC wurde von Grant Number GM068411 von Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award unterstützt. EO-R ist ein Fulbright-Conicyt (BIO 2008) und eine Rochester Vaccine Fellowship (2012) Empfänger. EO-R aktuellen Unterstützung wird durch ein Postdoc-Fellowship für Diversity &amp; Academic Excellence-vom Amt für Faculty Development &amp; Diversity an der Universität von Rochester zur Verfügung gestellt. Research in LM-S Labor wird durch die NIH Zuschüsse RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, die NIAID Centers of Excellence für Forschung und Influenza Surveillance (HHSN266200700008C) finanziert undDie University of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C). Forschung an JCT Labor wurde durch Zuschüsse RO1 AI047140, RO1 AI077719 und RO1 AI079665 von NIH unterstützt.

1. Arenavirus Rettung Transfektion Unsere Rettungssystem auf der Verwendung beider Polymerase II-Protein-Expressionsplasmide Codieren des Nucleoprotein (NP) und RNA-abhängige RNA-Polymerase-(L), die viralen trans-wirkende Faktoren für die RNA-Replikation und Genexpression des Arenavirus Genoms erforderlich basierend 7, 19, und in der Lage, Plasmide intrazellulären Synthese über die zelluläre RNA-Polymerase I (Pol-I), der S-und L-Antigenom RNA-Spezies 7 leiten. In unseren Untersuchungen verwenden wir die pCAGGS Proteinexpression Plasmid, das das Huhn β-Actin-Promotor und polyadenylanation (pA) Signalsequenzen verwendet, und die menschliche pol-I-Plasmid, die den menschlichen Polymerase I verwendet Promotor und Terminator-Sequenzen der Maus (Abbildung 2) . Die S-und L-RNA-Segmente in das HPOL-I-Plasmid in einer antigenomische Orientierung für die Erzeugung von genomischer RNA-Segmente bei der Transkription von HPOL-I lassen kloniert. Für die Rettung von Wildtyp-type rekombinanten LCMV (rLCMV) und offenen # 1 (rCandid # 1) der pCAGGS NP und L von jedem Virus zusammen mit ihren jeweiligen menschlichen Pol-I S und L RNA-Segmente (3) co-transfiziert. Erzeugung von rekombinantem trisegmented LCMV (r3LCMV) und Candid # 1 (r3Candid # 1) folgte ein ähnliches Protokoll, aber die S-Segment wurde in zwei verschiedenen pol-I S Plasmide, die jeweils für ein unverwechselbares Reportergen aufgeteilt: in eine, die NP open reading Frame (ORF) wurde mit dem Green Fluorescent Protein (GFP)-Reportergen (HPOL-I S GFP / GP) und in der anderen, die virale Glycoprotein Vorstufe (GPC) ORF mit dem Gaussia Luciferase (Gluc) Reporter-Gen ersetzt ist (HPOL-I S NP / Gluc). Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 4 dargestellt. Die folgende Transfektion und Infektion Protokoll wurde für 6-well-Platten aufgebaut. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) Mischung: Bereiten Sie 250 ul OptiMEM Medien und jeauf das Virus zu retten, 10 - 12 ug LPF2000 (1 ug / ul) pro Transfektion (Tabelle 1). Ein Verhältnis von 2,5 ug LPF2000 pro ug DNA wird empfohlen. Inkubation für 5 - 10 min bei RT. Unterdessen bereiten die Plasmidtransfektion Mischung in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchens (Schritt 1.2). </li><li> Plasmid-DNA Transfektion Mischung: Bereiten Sie die Plasmidtransfektion Cocktail in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit den empfohlenen Mengen für jeden Virus Rettung (siehe Tabelle 1). Bringen Sie das Endvolumen auf 50 ul mit OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000-DNA-Plasmid Mischung: In 250 ul der OptiMEM-LPF2000 Mischung (Schritt 1.1) in das Plasmid DNA Transfektion Mischung (Schritt 1.2). Inkubieren dieser Mischung für 20 - 30 min bei RT. Unterdessen bereiten und zählen 1 x 10 6 Zellen pro Vero Transfektionsreaktion. Vero-Zellen in Suspension transfiziert werden. </li><li> Vorbereitung von Vero-Zellen: Vero cells werden in 100 mm Schalen kultiviert. Vor dem Start bringen 1x PBS, DMEM 10% FBS 1% PS Medien und Trypsin-EDTA Gemisch auf 37 ° C. <ol><li> Waschen der Zellen zweimal mit 5 ml 1x PBS. </li><li> Trypsinize Zellen mit 1 ml Trypsin-EDTA und warten, bis die Zellen getrennt werden (ca. 5 min). Antippen vielleicht erforderlich, um vollständig lösen die Zellen von den Gerichten. </li><li> Vorsichtig die Zellen in 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugation der Zellen 5 min bei 1000 rpm in einer Zentrifuge. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 10 ml DMEM-10% FBS 1% PS und Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und stellen Konzentration auf 1 x 10 6 Zellen / ml. Es wurde festgestellt, daß 0,5 - 1 x 10 6 Vero Zellen pro Transfektion wurden die besten Ergebnisse erzielt. </li></ol></li><li> Mix LPF2000/DNA und Zellen: Nach 20 - 30 min Inkubation bei Raumtemperatur (Schritt 1.3), 1 ml von Vero-Zellen (1 x 10 6) (Schritt 1.4) zudie OptiMEM-LPF2000-DNA-Plasmid Mischung und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Seed LPF2000/DNA-cell Mischung in 6-well-Platten: Fügen Sie die DNA-LPF2000-Vero Mischung (Schritt 1.5) in die Vertiefungen der 6-Well-Platte. Schütteln Sie die 6-well-Platte und lassen Sie die Transfektion Inkubation über Nacht im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ändern Transfektionsmedium: Etwa 16 - 24 h nach der Transfektion, entfernen Sie die Transfektion Medien, 2 ml Infektion Medien und Inkubation transfizierter Zellen für eine zusätzliche 48 Stunden. </li><li> Zellpassage: Nach 48 Stunden Inkubation in Medien Infektion, entfernen Sie die Gewebekulturüberstand (TCS) und passieren die transfizierten Zellen in einer 100 mm-Schale. Der TCS selten enthält infektiösen Virus, weil die transfizierten Zellen zusätzliche Inkubation müssen Viruspartikel zu generieren. Für die Zellpassage: <ol><li> Waschen der Zellen zweimal mit 2 ml 1x PBS. </li><li> Trypsinize Zellen w<html> it 0,5 ml Trypsin-EDTA und warten, bis die Zellen lösen. </li><li> Die Zellen in 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS in einem 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifugation der Zellen 5 min bei 5000 rpm, 4 ° C in einer Mikrozentrifuge. </li><li> Vorsichtig werden die Zellen in 1 ml einer Infektion Medien und die Übertragung der Zellen in einer 100 mm-Schale. Um das Gesamtvolumen in der Platte, mit infektiösen Medien bis 8 ml, ein ausreichendes Volumen, um die Trocknung der Zellen, sowie zum Konzentrieren des Virus zu verhindern. </li></ol></li><li> Schütteln Sie die 100 mm-Schale und setzen die Inkubation von Vero-Zellen im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für 72 Stunden. </li><li> Sammlung von TCS: Nach 72-stündiger Inkubation, sammeln die TCS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation für 5 min bei 2500 rpm in einer Zentrifuge. Infektiöse Arenavirus im TCS gefunden wird, so von der Zelltrümmer Pellet Entfernung und Speicherung des TCS bei -80 ° C. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Bestätigung von rekombinanten Arenavirus Rettung Nachweis einer erfolgreichen Rettung von rLCMV und rCandid # 1 ist über dem Schwerpunkt bildende Einheit (FFU) Immunofluoreszenz-Assay (IFA) erreicht. Für Wildtyp-Virus Rettung verwenden wir spezifische Antikörper gegen das virale NP. Die r3LCMV und r3Candid Nr. 1 kodieren zwei Reportergene (GFP und Gluc), so dass virale Detektion und Titration ohne die Notwendigkeit von Antikörpern durch Fluoreszenzmikroskopie (GFP) und / oder Lumineszenz (Gluc). <ol><li> Bestätigen Wildtyp rekombinanten Arenavirus Rettung: Der Tag vor der Titration, waschen Vero-Zellen zweimal mit PBS, trypsinize und bereiten 96-Well-Platten bis 80 zu erreichen - 90% Zusammenfluss nächsten Tag (4 x 10 4 Zellen / well). Schütteln Sie die Platten von Hand auf einen uniformierten Verteilung der Zellen zu erhalten. Kultur die Zellen über Nacht in der 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um eine Monoschicht zu bestätigen, bevor mit der Infektion: <ol><li> Serienmäßig verdünnen (10 fache Verdünnungen) das Virus enthaltenden TCS erholte sich von den transfizierten Zellen in der 100-mm-Schale (Schritt 1.10) in OptiMEM. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus den gesäten Vero-Zellen, zweimal waschen mit 50 ul 1x PBS und infizieren Zellen mit 50 ul der seriell verdünnten Virus (Schritt 2.1). Infect Zellen für 1,5 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach der Infektion, entfernen Sie die Virusinokulum, fügen Sie 100 ul Infektion Medien / well und Inkubation der Zellen für 16 - 18 Stunden. Viral Re-Infektion kann nach 18-stündiger Inkubation führen, was in Überschätzung der viralen Titer führen. </li><li> Bei 16 - 18 Stunden nach der Infektion, entfernen Sie den TCS aus jeder Vertiefung und fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd in 1x PBS verdünnt, für 15 min bei RT. </li><li> Dann entfernen Sie den Fixierungslösung und permeabilisieren die Zellen mit 0,1% Triton X-100 verdünnt in 1x PBS, für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Saugen Sie die Permeabilisierung Lösung, dann waschen Sie die Zellen 3 mal with 1x PBS. </li><li> Blockieren der Zellen mit 2,5% Rinderserum Albumin (BSA) in 1x PBS (Blockierungslösung) für 1 h bei RT. Alternativ können die Zellen über Nacht bei 4 ° C blockiert und weiterhin mit Antikörper-Inkubation des folgenden Tages. </li><li> Inzwischen bereitet die primären Antikörper. Verdünnen Sie die LCMV-und Candid # 1-spezifischen primären Antikörper in Blocking-Lösung und dann zentrifugiert den Antikörper / Blocking-Lösung für 15 min bei 3.500 Umdrehungen pro Minute. Der monoklonale anti-LCMV NP Antikörperklon 1.1.3 (1:30 Verdünnung) 16 und der monoklonale anti-NP JUNV Antikörper SA02-BG12 von BEI Ressourcen (1:500 Verdünnung) können für den Nachweis von rLCMV und rCandid Nr. 1 verwendet werden sind. </li><li> Nach einer 1-stündigen Inkubation absaugen Blocking-Lösung und 50 ul des primären Antikörpers an die Zellen und Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C. </li><li> Zu diesem Zeitpunkt verdünnen sekundären Antikörper in Blocking-Lösung, und dann zentrifugiert, die den Antikörper / Blockieren Lösung für 15 min bei 3.500 UpM. Das Polyklonalen Kaninchen-anti-Maus-IgG-FITC sekundären Antikörper für den Nachweis von primären monoklonalen Antikörper wurde verwendet, um Bilder in 5 beobachtet erhalten. </li><li> Nach 1 Stunde Inkubation absaugen primärer Antikörper, 3 x waschen mit 1x PBS, und fügen Sie die sekundären Antikörper für 30 min bei 37 ° C </li><li> Nach 30 min Inkubation absaugen sekundären Antikörper und waschen 3 mal mit 1x PBS. Die Zellen sind nun bereit, beobachtet werden mittels Fluoreszenzmikroskopie sowohl bestimmen den Erfolg von viralen Rettung und Titration durch Zählen der Schwerpunkt bildende Einheiten pro ml (FFU / ml). </li></ol></li><li> r3LCMV und r3Candid Nr. 1 virale Rettung: Da diese Viren zwei Reporter Gene exprimieren, rettet ihr kann durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden, um die GFP-Expression oder Gluc Ausdruck in TCS erkennen. Rettung kann auch durch die Expression von Gluc werden in TCS bestätigt. Um die trisegmented Viren titrieren, wir Schritte 2.1 bis 2.1.4 folgen, jedoch Zellen nicht zu b brauchene befestigt, um eine erfolgreiche virale Rettung, weil der GFP-Expression zu bestimmen. Die Titration des Virus wird durch Zählen der FFU / ml bestimmt werden. Um eine erfolgreiche virale Rettung durch Gluc Ausdruck, Gluc Ausdruck von TCS bestimmen kann unter Verwendung eines Gluc Assay-Kit (Biolux Gaussia Luciferase Assay Kit, New England Biolabs) werden. Zu diesem Zweck: <ol><li> Je 100 ul TCS in eine 96-Well-Platte, weiß (Flat Mikrotiterplatten, Fisher Scientific). </li><li> Richten Sie das Luminometer (LumiCount, Packard Biosciences). </li><li> In 50 - 100 ul Gluc Assay-Lösung (wie vom Hersteller empfohlen) zu jeder Probe und messen Sie die Gluc Reporter Genexpression mit dem Luminometer. Als Negativ-Kontrolle wurde Gluc Ausdruck des TCS von den Wildtyp-Viren infizierten Zellen gemessen. </li></ol></li></ol> 3. Passage von Gewebekulturüberstände Viral Rettung hängt Transfektionseffizienzen. Vero-Zellen wurde gezeigt,zu niedrigeren Transfektionseffizienzen als andere Zelllinien 14 haben. Wenn Virustiter in der TCS niedrig sind, infizieren frisch Vero-Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 (LCMV) bzw. 0,1 (Candid # 1) für 72 Stunden, um das Virus zu verstärken.

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Erzeugung von rekombinanten Arenaviren Verwendung von Plasmid-basierte reverse Genetik Techniken hat sich zu einem weit verbreiteten Ansatz zur Untersuchung der vielen verschiedenen Facetten der Arenavirus Biologie. Hier dokumentieren wir eine entscheidende Verbesserung des derzeitigen Systems durch Ausführen Arenavirus rettet in Vero-Zellen, so dass für das Potenzial Generation von FDA-zugelassenen Impfstoff-Kandidaten gegen Arenaviren und Vakzinvektoren gegen andere Infektionskrankheiten. <p class="jove_content"...

Arenaviren sind umhüllte Viren mit einem bisegmented negative RNA-Genom, dass 3 der Arenaviridae Familie gehören. Die Arenavirus Genom kodiert vier Proteine ​​in einer AmbiSense Mode aus zwei getrennten viralen Segmente 3. Der große (L)-Segment kodiert für das RNA-abhängigen RNA-Polymerase (L) und die kleine RING (Really Interesting New Gene) finger protein (Z), die als die wichtigste treibende Kraft der Virusknospung dient. Die kleinen (S)-Segment kodiert für das virale nucleoprotein (NP) und die Oberflächen-Glykoprotein (GP) (Abbildung 1). Mehrere Mitglieder der Familie Arenaviridae sind verantwortlich für die tödlichen hämorrhagischen Fieber (HF) in Menschen 3. Grundsätzlich Bedenken sind Lassa-Virus (LASV) und Junín Virus (JUNV), die bekanntlich hohe Mortalität bei hospitalisierten Patienten 8, 9 verursachen. Obwohl diese Viren sind endemisch in Westafrika und ländlichen Argentinien, bzw.mehren sich die Bedenken der Einfuhr von LASV und JUNV zu nicht-endemischen Gebieten aufgrund der erhöhten Reise 10. Dazu kommt, obwohl in der Regel nicht mit einer schweren Krankheit in den Menschen verbunden sind, wird die prototypische Arenavirus lymphatischer Choriomeningitisvirus (LCMV) einen vernachlässigten Erreger gilt als es Fälle von tödlichen Infektionen bei immungeschwächten Patienten 6, 15 und ist verantwortlich für angeborene Missbildungen und Fehlgeburten bei schwangeren Frauen 2, 13. Derzeit gibt es keine FDA-zugelassenen Impfstoffe gegen Arenaviren und Behandlung der Nukleosid-Analogon Ribavirin, die nur teilweise wirksam ist und oft mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden ist, begrenzt. Die Einführung von Plasmid-basierte reverse genetics 4 und Erzeugung rekombinanter Arenaviren 7, 19 haben stark auf dem Gebiet der Forschung Arenavirus fortgeschritten. Derzeit werden Nagerzellen (wie BHK-21) für die Gener verwendetation von rekombinanten Arenaviren aufgrund der artspezifischen murine RNA-Polymerase I (pol-I) Promotor, der die anfängliche Transkription der S-und L-Segmente. Allerdings Virus Rettung in BHK-21-Zellen sind keine anerkannte Methode zur Erzeugung von rekombinanten Arenaviren als potentielle Vakzine Saatgut Kandidaten. Hier dokumentieren wir die Verwendung des menschlichen pol-I-Promotor für eine effiziente Rettung des prototypischen Alten Welt (OW) LCMV und der Neuen Welt (NW) JUNV Candid # 1-Stamm in Vero-Zellen. Mit einer ähnlichen Methode erzielten wir rekombinantes trisegmented LCMV (r3LCMV) und Candid # 1 (r3Candid # 1) Arenaviren, die zwei zusätzliche fremde Gene in zwei verschiedene S RNA Segmente 5 codiert enthalten. Dieses neue System nicht nur folgt eine hohe Reproduzierbarkeit und einfache Protokoll, sondern sofort in der Erzeugung von rekombinanten Arenaviren als potentielle Vakzine oder Impfvektor Samen eingeführt werden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Material and methods&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;strong&gt;Cell lines&lt;br/&gt; &lt;/strong&gt;Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 &amp;deg;C incubator with 5 % CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586).&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;Plasmids&lt;br/&gt; &lt;/strong&gt;All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 &amp;deg;C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 &amp;deg;C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer&#039;s recommendations and stored at -20 &amp;deg;C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis.&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;Viruses&lt;br/&gt; &lt;/strong&gt;The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed.&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;Tissue culture media and solutions&lt;br/&gt; &lt;/strong&gt;&lt;strong&gt;DMEM 10 %FBS 1 %PS:&lt;/strong&gt; 445 ml Dulbecco&#039;s modified Eagle&#039;s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 &amp;deg;C. This media will be used for maintenance of Vero cells.&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;Infectious Media:&lt;/strong&gt; 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 &amp;deg;C. This media will be used during viral infections.&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;10X Phosphate buffered saline (PBS):&lt;/strong&gt; 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 2 g of KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;. Add ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;1X PBS:&lt;/strong&gt; Dilute 10X PBS 1:10 with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;2.5 % BSA&lt;/strong&gt;: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 &amp;deg;C. This is used as a blocking solution for IFA. </td></tr></tbody></table>

generation of recombinant arenavirus for vaccine development in fda-approved vero cells

Die Entwicklung und Umsetzung von Arenavirus reversen Genetik stellt einen bedeutenden Durchbruch in der Arenavirus Feld 4. Die Verwendung von zellbasierten Arenavirus Minigenom Systeme zusammen mit der Fähigkeit, rekombinante infektiöse Arenaviren mit vorgegebenen Mutationen in ihrem Genom erzeugen hat die Untersuchung der Beteiligung von viralen Faktoren zu den verschiedenen Stufen des Lebenszyklus Arenavirus sowie Virus-Wirt erleichtert Wechselwirkungen und Mechanismen der Pathogenese Arenavirus 1, 3, 11. Darüber hinaus hat die Entwicklung von trisegmented Arenaviren die Verwendung der Arenavirus Genom zusätzliche fremde Gene von Interesse exprimieren gestattet und eröffnet damit die Möglichkeit, Arenavirus basierender Impfstoff Vektor Anwendungen 5. Ebenso bietet die Entwicklung von Single-Cycle-infektiösen Arenaviren auszudrücken vermag Reportergene ein neues experimentelles Werkzeug, um die Sicherheit der Forschung mit highl verbesserny pathogenen menschlichen Arenaviren 16. Die Erzeugung von rekombinanten Arenaviren Verwendung von Plasmid-basierte reverse Genetik Techniken bislang auf die Verwendung von Nagetier-Zelllinien 7,19, die einige Hindernisse für die Entwicklung der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Impfstoff-oder Vakzinvektoren Posen verlassen. Um dieses Hindernis zu überwinden, beschreiben wir hier die effiziente Erzeugung von rekombinanten Arenaviren in FDA-zugelassenen Vero-Zellen.

Erfolgreiche Rettung eines rekombinanten Wildtyp Arenavirus wird durch das Vorhandensein von viralen Antigenen mit IFA (Fig. 5) bestätigt werden. Im Falle von rekombinanten Viren trisegmented können erfolgreiche virale Rettung durch Beobachtung GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie (6A) beurteilt werden. Erfolgreiche Rettung wird weiter durch die Beurteilung Gluc Ausdruck (6B) bestätigt werden. Repräsentative Ergebnisse, welche die erfolgreiche Rettung von W...

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Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erzeugung und sichere Impfstoffe zur Bekämpfung von humanpathogenen Arenaviren.

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

generation-recombinant-arenavirus-for-vaccine-development-fda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.9K Aufrufe.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erze...

Serie: Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both as an oncolytic virus and a viral-vectored vaccine. NDV is an attractive therapeutic and prophylactic agent due to its well-established reverse genetics system, potent immunostimulatory properties, and excellent safety profile. When administered as an oncolytic virus or a viral-vectored vaccine, NDV elicits a robust antitumor or antigen-specific immune response, activating both the innate and adaptive arms of the immune system. 
Given these desirable characteristics, NDV has been evaluated in numerous clinical trials and is one of the most well-studied oncolytic viruses. Currently, there are two registered clinical trials involving NDV: one evaluating a recombinant NDV-vectored vaccine for SARS-CoV-2 (NCT04871737), and a second evaluating a recombinant NDV encoding Interleukin-12 in combination with Durvalumab, an antiPD-L1 antibody (NCT04613492). To facilitate further advancement of this highly promising viral vector, simplified methods for generating high-titer, in vivo-grade, recombinant NDV (rNDV) are needed. 
This paper describes a detailed procedure for amplifying rNDV in specified pathogen-free (SPF) embryonated chicken eggs and purifying rNDV from allantoic fluid, with improvements to reduce loss during purification. Also included are descriptions of the recommended quality control assays, which should be performed to confirm lack of contaminants and virus integrity. Overall, this detailed procedure enables the synthesis, purification, and storage of high-titer, in vivo-grade, recombinant, lentogenic, and mesogenic NDV for use in preclinical studies.

Here we provide a detailed procedure for production, purification, and quantification of high-titer recombinant Newcastle disease virus. This protocol consistently yields &#62; 6 &#215; 109 plaque-forming units/mL, providing virus quantities appropriate for in vivo animal studies. Additional quality control assays to ensure safety in vivo are described.

Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Krebsforschung

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

Generierung von rekombinanten aviären Herpesvirus Vektoren mit CRISPR/Cas9 gen bearbeiten

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian and avian host species, including humans. With the recent advent of rotavirus reverse genetics systems, it has become possible to use directed mutagenesis to explore rotavirus biology, modify and optimize existing rotavirus vaccines, and develop rotavirus multitarget vaccine vectors. In this report, we describe a simplified reverse genetics system that allows the efficient and reliable recovery of recombinant rotaviruses. The system is based on co-transfection of T7 transcription vectors expressing full-length rotavirus (+)RNAs and a CMV vector encoding an RNA capping enzyme into BHK cells constitutively producing T7 RNA polymerase (BHK-T7). Recombinant rotaviruses are amplified by overseeding the transfected BHK-T7 cells with MA104 cells, a monkey kidney cell line that is highly permissive for virus growth. In this report, we also describe an approach for generating recombinant rotaviruses that express a separate fluorescent reporter protein through the introduction of a 2A translational stop-restart element into genome segment 7 (NSP3). This approach avoids deleting or modifying any of the viral open reading frames, thus allowing the production of recombinant rotaviruses that retain fully functional viral proteins while expressing a fluorescent protein.

Generation of recombinant rotaviruses from plasmid DNA provides an essential tool for the study of rotavirus replication and pathogenesis, and the development of rotavirus expression vectors and vaccines. Herein, we describe a simplified reverse genetics approach for generating recombinant rotaviruses, including strains expressing fluorescent reporter proteins.

Vereinfachte Reverse Genetics-Methode zur Wiederherstellung rekombinanter Rotaviren, die Reporterproteine ausdrücken

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.

Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased biosafety and stability over use of live pathogens. Non-infectious and self-assembling, VLPs are used to present structural proteins as immunogens, bypassing the need for live pathogens or recombinant viral vectors for antigen delivery. In this article, we demonstrate the different stages of VLP design and development for future applications in preclinical animal testing. The procedure includes the following stages: selection of antigen, expression of antigen in cell line of choice, purification of VLPs/SVPs, and quantification for antigen dosing. We demonstrate use of both mammalian and insect cell lines for expression of our antigens and demonstrate how methodologies differ in yield. The methodology presented may apply to a variety of pathogens and can be achieved by substituting the antigens with immunogenic structural proteins of the user&#39;s microorganism of interest. VLPs and SVPs assist with antigen characterization and selection of the best vaccine candidates.

Here, we present a protocol for synthesizing virus-like particles using either baculovirus or mammalian expression systems, and ultracentrifugation purification. This highly customizable approach is used to identify viral antigens as vaccine targets in a safe and flexible manner.

Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

Zusammenfassung

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