Name: application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria
Uploaded: 2015-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
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This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

1. Synthese von 10 nm Goldnanopartikel (Gold-Nanopartikel) 15 <ol><li> Bereiten Lösung A: 2 ml 1% ige wässrige Goldchlorid in 160 ml Milli-Q oder doppelt destilliertes Wasser. </li><li> Bereiten Lösung B: 8 ml 1% Trinatriumcitrat x 2 H 2 O und 160 ul 1% Gerbsäure in 32 ml Milli-Q oder doppelt destilliertes Wasser. </li><li> Warm up-Lösung A und B auf 60 ° C und mischen sie unter Rühren. Beachten Sie eine dunkelblaue Farbe sofort. Beachten rot nach ca. 15 min. Dann heizen bis zu 95 ° C, 5 Minuten zu halten und die Lösung auf RT. </li><li> Fügen Sie einen Tropfen des NP Suspension auf eine kohlenstoffbeschichteten Netz und lassen an der Luft trocknen. Überprüfen Sie die Größe und Morphologie der NPs durch Transmissionselektronenmikroskopie. </li></ol> 2. Beschichtung von Gold-Nanopartikel, die mit BSA und Markierung mit Rhodamin N-Hydroxysuccinimidylester (NHS) 16 <ol><li> Hinzufügen 900 ul NPs in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, Zentrifuge bei 15.000 × g für 30 min. Opnational, bereiten mehrere Rohre auf einmal. </li><li> Überstand verwerfen, resuspendieren Sie das Pellet in 900 ul sterilisiert Milli-Q-Wasser und fügen Sie 100 ul 2 mg / ml BSA / PBS, Mischen auf einem Vortex bei 800 Upm für 30 min. </li><li> So entfernen Sie überschüssiges BSA, zentrifugieren Sie das Präparat bei 15.000 · g für 60 min. </li><li> Überstand verwerfen und neu zu suspendieren die Gold-BSA-Nanopartikel in 125 ul PBS, fügen 12,5 ul 1 M Bicarbonat. </li><li> Unmittelbar vor der Anwendung bereiten eine 10 mg / ml-Lösung von Rhodamin NHS / DMSO, fügen Sie 30 ul Rhodamin NHS / DMSO-Lösung des Gold-BSA-Nanopartikel-Suspension 1 ml. Inkubieren Sie die Reaktion für 2 Stunden (oder O / N) bei RT bei 800 Umdrehungen pro Minute Misch, vermeiden Belichtung. </li><li> Reinigung der Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel durch Dialyse gegen PBS bei 4 ° C mit 5 Pufferänderungen über den Zeitraum von 36 bis 48 h. </li><li> Zur Stabilisierung NPs, fügen Sie 10 ul der 200 mg / ml BSA / PBS in jeden 1 ml Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel. Um die freien oder frei BSA-Rhodamin, Zentrifuge bei 15 zu entfernen,000 × g für 60 min. Das Pellet in 2 mg / ml BSA / PBS, messen OD 520, und bei 4 ° C, vermeiden Belichtung. </li><li> Verdünnen Sie die NPs 10 mal mit Milli-Q bzw. doppelt destilliertes Wasser, einen Tropfen auf ein kohlenstoffbeschichtetes Gitter, und lassen Sie sie an der Luft trocknen lassen. Prüfen Größe und Morphologie der Nanopartikel durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Hinweis: alle für NP Herstellung verwendeten Materialien wurden sterilisiert und der Vorgang wurde in einem Zellkulturhaube oder auf einer Bank neben einer Flamme durchgeführt. </li></ol> 3. Kultur von HeLa-Zellen <ol><li> HeLa Zellen LAMP1-GFP exprimieren, sind dauerhaft in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) kultiviert und bei 37 ° C in einer Atmosphäre mit 5% CO 2 gezüchtet. </li><li> Samen, die Zellen in einer Dichte von 50.000 pro Vertiefung in einem 8-Well-Kammerobjektträger (Ibidi) und Inkubation O / N. </li></ol> 4. Kultur von Bakterien <ol><li> Verwenden Salmonella enterica Serovar Typhimurium NCTC 12023 wild-Typ (WT) Belastung. Zum Vergleich verwenden Mutantenstämmen Δ ssaV im SPI2-T3SS und Δ SIFA defekt fehlt Schlüssel Effektor SIFA für SIF. Verwenden Stämme Plasmid pFPV25.1 für konstitutive Expression verstärkt GFP. HINWEIS: Die Bakterienstämme sind routinemßig gezüchtet in Luria-Bertani-Brühe (LB), mit Zusatz von 50 ug / ml Carbenicillin (WT) und LB unter Zusatz von 50 ug / ml Carbenicillin und / oder 50 &amp; mgr; g / ml Kanamycin (Δ ssaV, Δ Şifa ) der erforderlich ist, um Plasmide zu erhalten. </li><li> Impfen Sie eine einzelne Bakterienkolonie in 3 ml LB mit geeigneten Antibiotika und wachsen O / N bei 37 ° C unter Schütteln Bedingungen für die Belüftung, dann verdünnen 01.31 in frischem LB und das Wachstum weiterhin 3,5 Stunden. Zu diesem Zeitpunkt, erreichen die Kulturen der späten log-Phase und Bakterien sehr invasiv. A &#39;Bandage &quot;ist bequem, Reagenzglas Kulturen mit Belüftung inkubiert. </li></ol> 5. Die Infektion von HeLa-Zellen durchSalmonellen and Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel Pulse Chase-Kennzeichnung (siehe Abbildung 1 für Schema) <ol><li> Messen OD 600 der Unter kultivierten Bakterien und verdünnt in 1 ml PBS (~ 3 × 10 8 cfu / ml) OD 600 = 0,2, fügen geeignete Mengen von Bakterien an HeLa-Zellen in 8-Well-Kammerobjektträgern, eine Vielzahl von zu erzielen Infektion (MOI) von 100. </li><li> Inkubieren für 30 Minuten in der Zelle Inkubator, waschen 3 Mal mit PBS, um nicht internalisierte Bakterien zu entfernen (dieser Zeitpunkt wurde als 0 Stunden nach der Infektion oder 0 h pi festgelegt). Werden 300 ml frisches Kulturmedium, das 100 ug / ml Gentamicin und aufrechtzuerhalten für 1 h. Dann ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium, das 10 ug / ml Gentamicin für den Rest der Inkubationszeit. </li><li> Nach Inkubation mit Kulturmedium, das 100 ug / ml Gentamicin für 1 h wird das Medium durch Abbilden Medium ersetzt (Eagles MEM ohne FCS, L-Glutamin, Phenolrot und Natriumbicarbonat, mit 30 mM HEPES, pH 7,4) containing 10 ug / ml Gentamicin. Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel werden in HeLa-Zellen gegeben, um eine Endkonzentration von OD 520 = 0,1 erhalten. HINWEIS: Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel können auch auf Zellen vor der Infektion, oder zu verschiedenen Zeitpunkten zugegeben werden pi </li><li> Nach 1 h Inkubation Entfernen des Mediums, Waschen 3x mit PBS, und 300 ml frisches Bilderzeugungsmedium, enthaltend 10% FCS und 10 ug / ml Gentamicin für den Rest der Inkubationszeit. HINWEIS: Dauer der Inkubationszeit kann je nach Konzentration von Nanopartikeln und Zelllinien variieren. Für Makrophagen RAW264.7 beobachteten wir, dass 30 min Inkubation mit Nanopartikeln in einer Konzentration von OD 520 = 0,05 erhalten ausreichend Internalisierung. </li></ol> 6. Imaging <ol><li> Verwenden eines konfokalen Abbildungssystems, wie einem konfokalen Laser-Scanning (CLSM) oder Spinnscheibe (SD) Mikroskop mit einer feuchten Umgebung Kammer hochauflösende Abbildung zu unterschiedlichen Zeitpunkten. </li><li> Schalten Sie den Temperatur control System und warten, bis er stabil ist. Optimieren Sie die Bildeinstellungen, wie Vergrößerung, Scangeschwindigkeit, Auflösung, Z-Stapel usw. Verwenden Sie geeignete Anregungs- / Emissions Einstellungen für GFP und Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel. Aus diesem Protokoll, mit einem 400 Hz Scangeschwindigkeit, Auflösung von 512 x 512 Bildpunkten und Z-Schrittgröße von 0,25 um. Erregt GFP und Gold-BSA-Rhodamin Verwendung eines Ar-Lasers (488 nm) und einen HeNe-Laser (543 nm) sind. Fügen Sie eine Hellfeld (BF) Kanal für die Beobachtung der Form der Zellen. Bei anderen Mikroskopsystemen und Infektionsbedingungen die Einstellung muss entsprechend angepasst werden. HINWEIS: Die gleichen Ar-Laser als die Lichtquelle der BF Kanal und Signal wurde mit einem Photomultiplier (PMT) Detektor erfaßt. </li><li> Bei der angegebenen Zeitpunkten pi, montieren Sie die 8-Well-Kammer-Objektträgern, die infizierten Zellen auf dem Mikroskoptisch und speichern. </li></ol> 7. Analyse der Bilder <ol><li> Verwenden Mikroskopie Bildanalyse-Software (siehe <strong&gt; Materialien und Geräte der Tabelle), um den Umbau des Endo-lysosomalen System durch intrazelluläre Salmonellen zu untersuchen. Öffnen Sie die Daten, indem Sie auf &quot;Öffnen&quot; und wählen Sie die Datei. HINWEIS: Alternativ können Open-Source-Softwarepakete wie ImageJ oder FIJI quantitative Bildanalysen verwendet werden. </li><li> In der Symbolleiste Objekte des auf das Icon Surpass Sicht <img alt="Symbol" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" /> um eine neue Oberfläche Artikel hinzuzufügen. Klicken Sie auf <img alt="Symbol" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (Nächster). </li><li> So analysieren Sie eine Region of Interest (ROI), wählen Sie Segment ein ROI. In einer Bildfläche wird ein Rechteck umrandeten Abschnitt Bild überlagert, die den ROI. Geben Sie die Werte in der entsprechenden x-, y- und z-Felder, oder klicken Sie direkt auf die Pfeile in der Vorschau Rechteck, um Größe und Position der ROI ändern. Klicken Sie dann auf <img alt="Symbol" fo:content-width=".1in" src<html> = &quot;/ Files / ftp_upload / 52.058 / 52058icon2.jpg&quot; /&gt; (Next). </li><li> Als Quellkanal, wählen Sie Kanal 3 (Signal for Gold-BSA-Rhodamin NPs). Überprüfen Sie die glatte Option zum Einrichten der Glätte der resultierenden Fläche. Wert manuell festlegen oder den automatisch generierten Wert zu übernehmen. Für Threshold, wählen Sie die Option Absolute Intensität. </li><li> Für die Schwelleneinstellung, wählen Sie die manuelle Option wählen und Wert. Im Anzeigebereich wird eine Oberflächengrenze Vorschau grau dargestellt. </li><li> Auf der Registerkarte Classify Oberflächen können die resultierende Oberfläche nach verschiedenen Kriterien gefiltert werden. Ein Standardfilter ist &quot;Anzahl der Voxel&gt; 10 &#39;und andere Filter können auch durch Klicken auf&quot; Hinzufügen &quot;aufgenommen werden. Wenn eine Filterung nicht notwendig ist, dann alle Filter zu löschen, indem Sie auf die Schaltfläche Löschen. Klicken <img alt="Symbol" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (Nächster). </li><li> Um Oberflächen Erstellung abzuschließen, klicken Sie auf/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg &quot;/&gt; (Fertig stellen). In der Liste Objekt jetzt deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für das Element Volume und erstellt neue Oberfläche in Sichtbereich angezeigt. </li><li> Exportieren Sie die Statistiken. Jetzt, in der Surpass Ansicht die Farbe der Themen variieren von violett bis rot nach ihrem Bereich. Und die &quot;Plot Zahlen Raums&quot; Tabelle zeigt die Statistikinformationen (zB ID-Nummer und Fläche von Objekten). Exportieren Sie alle Statistiken der Oberfläche 1 in eine Excel-Datei durch Klick <img alt="Symbol" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" /> (Speichern). </li></ol>

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Die endo-lysosomalen System von Säugerzellen steuert wichtige physiologische Prozesse, einschließlich der Nahrungsaufnahme, Hormon-vermittelten Signaltransduktion, Immunüberwachung und Antigen-Präsentation 17. Bisher wurde eine Vielzahl von Markern für die Kennzeichnung von endocytischen und Tracking-Studien verwendet. Beispielsweise Lysotracker Sonden fluoreszierend acidotropic Sonden von Molecular Probes (Life Technologies, USA) zum Lysosom Kennzeichnung entwickelt, das sich selektiv anreichernde in ze...

Fluoreszierende Nanopartikel (NPs), einschließlich Metall-Nanopartikel, Quantenpunkte, Polymer-Nanopartikel, Silica-Nanopartikel, Carbon Punkte usw., haben in den vergangenen Jahrzehnten 1,2 beträchtliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Im Vergleich zu herkömmlichen organischen Farbstoffen, fluoreszierenden Nanopartikeln zeigen wünschenswerte chemische, optische und mechanische Eigenschaften, wie starke Signalstärke, Resistenz gegen Ausbleichung und hohen Biokompatibilität 3,4. Diese Vorteile machen sie die Methode der Wahl für die intrazelluläre Erkundung und Live Cell Imaging. Darüber hinaus sind eine Vielzahl von elektronendichte Nanopartikel durch Elektronenmikroskopie (EM) zu sehen, ihre Verwendung zur korrelierten mikroskopische Analyse, die Kombination von Live-Cell-Tracking mit Lichtmikroskopie (LM) und eine höhere Auflösung bei ultrastruktureller Ebene mit EM 5 ermöglicht die Erleichterung. So wurden beispielsweise Gold-Nanopartikel lange Zeit effizient als Biosensoren in lebenden Zellen für empfindliche Diagnose sowie auf dem Gebiet der Immunmarkierung 6 verwendet wurde. Neueste sTUDIEN zeigen, dass Gold-Nanopartikel mit unterschiedlicher Größe und Form kann leicht sein, die Aufnahme durch eine Vielzahl von Zelllinien und routinemäßig durch den endosomalen Weg zu transportieren, daher haben ein großes Potenzial für die intrazelluläre Vesikel Befinden Transportverfolgung und der endo-lysosomalen System Kennzeichnung angewandt 7,8 . Mikrobiellen Krankheitserregern wie Salmonella enterica, Shigella flexneri und Listeria monocytogenes, wurden verschiedene Mechanismen entwickelt, um nicht-phagozytischen Wirtszellen 9 einzudringen. Nachdem sie verinnerlicht, die Erreger entweder im Cytosol lokalisiert oder in membrangebundene Kompartimente abgesondert, interagieren intensiv mit ihrer Host-Umgebungen und moduliert diese auf ihr eigenes Überleben 10 begünstigen. Zum Beispiel befindet sich Salmonella enterica und repliziert in ein intrazelluläres phagosomalen Raum bezeichnet die Salmonellen-haltigen Vakuole (SCV) nach Infektion 11. Die Reifung SCVVerkehre zu den Golgi-Apparat, das fortlaufend Wechselwirkungen mit dem endocytischen und induziert die Bildung von ausgedehnten röhrenförmige Strukturen, wie Salmon -induzierte Filamente (SIF), Sortierung nexin Tubuli, Salmon -induzierte sekretorischen Trägermembranprotein 3 (SCAMP3) Tubuli, usw. . 12-14. Studium, wie diese bakterielle Erreger manipulieren Wirtszellsignalwege ist wesentlich für das Verständnis von Infektionskrankheiten. Hier wurden Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel als Flüssigkeit Tracer verwendet, um die Wirtszellen endo-lysosomalen System kennzeichnen, und der menschlichen Magen-Erreger Salmonella enterica Serovar Typhimurium (Salmonella) wurde als Modellbakterium verwendet, um die Wechselwirkungen des Erregers mit dem Studium Gastgeber endocytischen. Intrazellulären Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel in nichtinfizierten Zellen und Zellen, die mit WT oder Mutante Salmonella-Stämmen infiziert wurden mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop (CLSM) abgebildet.Dann wurde Imaris Software verwendet, um die Verteilung von Nanopartikeln zu quantifizieren, was anzeigt, daß Salmonella-Infektion induzierten extreme Umlagerung der Endosomen / Lysosomen. Nach der Beschreibung dieser Methode kann analoge Experimente entwickelt, um langfristige Schicksal der internalisierten NPs zu verfolgen und um den Einfluss der verschiedenen exogenen Substanzen oder endogenen Faktoren auf die endocytischen von eukaryontischen Zellen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Gold chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Tannic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Rhodamine</td><td>Pierce</td><td>46406</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Applichem</td><td>A1492</td><td></td></tr><tr><td>Kanamcyin</td><td>Roth</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Roth</td><td>6344</td><td></td></tr><tr><td>8-well chamber slides</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>tissue culture treated, sterile</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td>version 7.6</td><td>various configurations available</td></tr></tbody></table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

Fluoreszierende Nanopartikel (NPs) mit wünschenswerten chemischen, optischen und mechanischen Eigenschaften sind versprechendsten Mittel, um intrazelluläre Organellen zu beschriften. Hier stellen wir ein Verfahren unter Verwendung von Gold-BSA-Rhodamin-Nanopartikel, die endo-lysosomalen Systems eukaryontischer Zellen zu markieren und Manipulationen von Wirtszellwege zu überwachen, indem die intrazelluläre Pathogen Salmonella enterica. Die Nanopartikel wurden leicht durch HeLa-Zellen internalisiert und lokalisiert in späten Endosomen / Lysosomen. Salmonelleninfektion induzierte Umlagerung der Vesikel und Akkumulation von Nanopartikeln in Salmonella induzierten Membranstrukturen. Wir Einsatz der Imaris Softwarepaket für quantitative Analysen der konfokalen Mikroskopie Bilder. Die Anzahl der Objekte und ihre Größenverteilung in nicht-infizierten Zellen waren verschieden von denen in Salmonellen-infizierten Zellen, was eine überaus Umbau des endo-lysosomalen System WT Salmonellen.

Gold-Nanopartikel wurden durch ein gut etabliertes Verfahren durch Reduktion von Chlorwasserstoffsäure von Citrat und Gerbsäure erzeugt. Wie in 2A gezeigt, waren die synthetisierten NPs quasi-kugelförmiger Gestalt mit einer Größe von etwa 10 nm. BSA-Beschichtung und Rhodamin-Markierung nicht beeinflussen die Morphologie und Größe (2B). Es wurde berichtet, dass die Gold-Nanopartikel können leicht von verschiedenen Säugerzellen aufgenommen und am Ende...

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Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Synthese und die Fluoreszenzmarkierung von Nanopartikeln (NPs). Die Nanopartikel wurden in Pulse-Chase-Experimenten angewandt, um die Endo-lysosomalen System von eukaryotischen Zellen zu kennzeichnen. Eine Manipulation der endo-lysosomalen System Aktivitäten des intrazellulären Pathogen Salmonella ente wurden von Live Cell Imaging und quantifizierte gefolgt.

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Aufrufe.  Universität Osnabrück.  Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Synthese und die Fluoreszenzmarkierung von Nanopartikeln (NPs). Die Nanopartikel wurden in Pulse-Chase-Experimenten angewandt, um die Endo-lysosomalen System von eukaryotischen Zellen zu kennzeichnen. Eine Manipulation der endo-lysosomalen System Aktivitäten des intrazellulären Pathogen Salmonella ente wurden von Live Cell Imaging und quantifizierte gefolgt. 

Serie: Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

Analyse der Endocytic Aufnahme und retrograder Transport mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen mit dem Trans-Golgi-Netzwerk

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Forschung

Biochemie

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Immunologie und Infektion

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Neurowissenschaften

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Biologie

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

The Microscopy-Based Assay to Study and Analyze the Recycling Endosomes using SNARE Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in the biogenesis of melanosomes, a lysosome-related organelle produced by melanocytes. REs deliver the melanocyte-specific cargo to premature melanosomes during their formation. Blockage in the generation of REs, observed in several mutants of Hermansky-Pudlak syndrome, results in hypopigmentation of skin, hair, and eye. Therefore, studying the dynamics (refer to number and length) of REs is useful to understand the function of these organelles in normal and disease conditions. In this study, we aim to measure the RE dynamics using a resident SNARE STX13.

Recycling endosomes are part of the endosomal tubular network. Here we present a method to quantify the dynamics of recycling endosomes using GFP-STX13 as an organelle marker.

Der mikroskopiebasierte Assay zur Untersuchung und Analyse der Recycling-Endosomen mittels SNARE-Trafficking

Recycling endosomes (REs) are tubular-vesicular organelles generated from early/sorting endosomes in all cell types. These organelles play a key role in ...

An Introduction to Endocytosis and Exocytosis

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes involve lipid membrane-bound sacs called vesicles. Knowledge of the molecular architecture and mechanisms of both is key to understanding normal cell physiology, as well as the disease states that arise when they become defective. This video will first briefly review a few pivotal discoveries in the history of endo- and exocytosis research. Next, some key questions will be examined, followed by a discussion of the prominent methods used to investigate these problems, including cell labeling, fusion assays, and fluorescence imaging. Finally, it will explore current research being conducted by scientists in the field today.

Endocytosis and Exocytosis; Clathrin Coated Pits and SNAREs

Eine Einführung in die Endozytose und Exozytose

Cells can take in substances from the extracellular environment by endocytosis and actively release molecules into it by exocytosis. Such processes ...

Lehre

JoVE Science Education

Fortgeschrittene Biologie

Grundlagen der Zellbiologie

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging

Source: Tsuruta, F., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55488">Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates how neuronal vesicles are labeled with specific fluorescent proteins to visualize their movement. First, a plasmid coding for a fluorescent protein is incubated with a transfection agent and then introduced into a culture of neurons. Subsequently, images of the neurons are acquired and analyzed to track the vesicles&#39; movement.

Visualisierung von Vesikelmotilitäten in Neuronen mittels Fluoreszenzbildgebung

1. Imaging Vesicle Motility

	Prepare the plasmids that will label each type of vesicle. For instance, use EGFP-Rab5 for early endosomes, EGFP-Rab7 for ...

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Zusammenfassung

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