We thank Dr&#8217;s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.

1. Computational Identifizierung potenzieller Kleinmolekül Verkappungsgruppen Hinweis: Im Prinzip kann eine Vielzahl von Docken oder Pharmakophor Suchverfahren verwendet werden, um potentielle Verkappungsgruppen vorherzusagen. Der Hauptzweck der theoretischen Studien in REPLACE ist es, kleine Moleküle, die die Eigenschaften und Wechselwirkungen der Aminosäuren, die substituiert sind, behalten zu identifizieren. <ol><li> Validierung des LigandFit Docking-Protokoll 14 </li></ol> Hinweis: In früheren Studien, die Docking-Verfahren (LigandFit 15, ein Modul in der Molecular Modelling-Programm-Suite, Entdeckung Studio 3.0) wurde überprüft, um sicherzustellen, dass dieser Algorithmus ist ausreichend, um die Bindungsarten bekannt Ncaps zu reproduzieren und zu zeigen, dass die Ergebnisse für die erhaltenen unbekannte Verbindungen sind vorausschauende 14. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mit den folgenden Schritten (1,2 bis 1,5), zu identifizieren optimalen Parameter für LigandFit wie folgt: PLP1 enEnergiegitter für Pose Generation, Minimierung der erzeugten Posen und der PLP1-Bewertungsfunktion für die Analyse von Posen. </li><li> Um die erhaltenen Konformationen zu beschränken und Liganden in geeigneter Weise zur Bildung einer kovalenten Bindung in dem verkappten Peptid Position befindet, die Indol-Stickstoff und Amid-Stickstoffatome von Trp217 und Gln254 jeweils als Wechselwirkung Filter für Wasserstoffbrückenbindung. </li><li> Design und Dock eine Bibliothek von Fragment Alternativen in die CDK2 / Cyclin A-Rezeptor (2UUE). Priorisieren Potenzial Capping-Gruppen zur Synthese und kommerzielle Sourcing auf Basis von Scoring-PLP1, Interaktionen mit Interaktionsfilter und Komplementarität mit der CBG. Die verschiedenen Schritte für LigandFit Docking erforderlich sind wie folgt. </li></ol><ol start="2"><li> Herstellung der Rezeptorbindungsstelle 14 <ol><li> Importieren Sie die CDK2 / Cyclin eine Kristallstruktur (PDB ID: 2UUE) in eine Visualisierungsfenster in der Software. Diese Struktur enthält die zuvor identifizierten FLIP 5-methyl-1-phenyl-1H-1, 2,4-triazol-3-carboxamido (3,5-DCPT) RLIF den Cyclin Nut gebunden (Figur 3). </li><li> Löschen oder halten Sie an Ort und Stelle die Reste RLIF (C-Terminus). Wenn die Peptidsequenz beibehalten wird, verwenden die N-terminale Aminogruppe des Peptids als Interaktionsfilter für den Liganden. Von den &quot;Rezeptor-Ligand-Interaktionen&quot; Werkzeuge, erstellen Sie eine Kugel um den N-Kappe 3,5-DCPT von Show / site ausblenden Kugel. Die Kugel wird erstellt, um den aktiven Bereich in der Bindungsstelle in dem die Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen dürfen während der Bindung auftreten definieren. </li><li> Definieren Sie die Bindungsstelle weiter von der &quot;zu finden Website als Volumen von ausgewählten Liganden&quot;, und löschen Sie den Liganden 3,5-DCPT aus dem Protein. Führen Sie diesen Schritt, um die Lautstärke der Bindung innerhalb der Sphäre geschaffen definieren. </li><li> Eingestellt Indolstickstoff und Amid-Stickstoffatome der Reste Trp217 und Gln254 als Interaktionsfilter zur Wasserstoffbrückenbindung. Stellen Sie die Interaktion Filter, so dass nur die Posen, die interact mit den Atomen des Satzes Rückstände während des Docking-Prozess daher die Erhaltung wichtigen Wechselwirkungen in den angedockten Posen gefiltert werden. </li></ol></li><li> Herstellung von Liganden 14 <ol><li> Design eine Bibliothek von 100 Potential Verkappungsgruppen anhand von Kriterien, einschließlich Molekulargewicht von weniger als 500, das Vorhandensein einer Carboxylatgruppe zur Ligation mit dem trunkierten Peptids und Aufnahme geeigneter hydrophober Gruppen (substituierte Phenylgruppe) Van der Waals-Wechselwirkung im Sekundärfach als in Tabelle 1 gezeigt. </li><li> Wählen heterocyclische Ringe zum Nachahmen Peptid Wasserstoffbindungswechsel mit Trp217 und Substituenten enthalten zum Ersetzen Ionenpaar-Wechselwirkungen zwischen basischen Seitenketten des HAKRRLIF. Dock und die Liganden als jeweilige Aldehydmolekülen so daß der Carbonylsauerstoff mit dem Amid-Stickstoffatom Gln254 ähnlichen Peptid-Rückgrat in der Stammpeptids (Tabelle 1) zu interagieren. </li><li> Vor docKönig, zu minimieren, entwickelt Liganden auf einen niedrigen Energie Konformation und bereiten in geeigneter Ionisationszustand mit der &quot;Prepare-Liganden&quot; Protokoll. Zu ziehen und in die Software importiert exportieren diese potenziellen N-Kappen in der SDF-Datei-Format in ChemDraw für ein Spreadsheet vor. Hinweis: Bereiten Liganden-Protokoll wird verwendet, um alle Liganden zu minimieren, um auf den niedrigsten Energiezustände angedockt werden und die Ionisation Kosten wurden den geltenden Atomen angewandt. Default-Parameter für diesen Schritt verwendet. </li></ol></li><li> Docking der Liganden in die Cyclin A Groove 14 <ol><li> Wählen Sie das LigandFit Routine von Rezeptor-Ligand-Interaktionen Protokollsatz der Software. Verwenden Sie den Rezeptor und die vorbereiteten Liganden als Eingabe für dieses Protokoll. </li><li> Für diese Läufe wählen PLP1 als Energienetz, stellt fest, dass Energie minimiert werden, und dass die Anzahl der erzeugten Posen als 10. Lassen Sie alle anderen Parameter auf die Standardwerte. Hinweis: LigandFit isteine Docking-Verfahren, das mit der aktiven Stelle eines Proteins unter Verwendung einer Form basiert Vergleichsfilter, die mit einer Monte Carlo Konformationssuche Algorithmus kombiniert wird, zu erkennen und erzeugen kann Posen des hohen Grad an Komplementarität und potentielle Affinität. Das Energienetz von der Docking-Programm verwendet wird, ist das Kraftfeld zur Erzeugung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen und mögliche Posen. PLP1 stückweise linear Potential der spezifisch priorisiert Wasserstoffbindungswechsel und wobei die PLP Atomtyp wird für jeden Nicht-Wasserstoffligandenatom oder Nicht-Wasserstoff-Rezeptor Atom zugewiesen. </li></ol></li><li> Analyse der Ergebnisse <ol><li> In der ersten Instanz, stellt Anzeige im Visualizer Programm und dann sortieren nach absteigenden Werten der PLP1-Score. Verwenden Bewertungsfunktionen wie PLP1 abzuschätzen die Bindungsaffinität eines verankerten Liganden, der einen Ligandenkandidaten darstellen Geometrie und nicht-kovalente Wechselwirkung mit der Zielrezeptorstruktur. Hinweis: Hier wird das PLP1 Bewertungsfunktion zu g gefunden wurdeive die besten Ergebnisse, da es eine Abschätzung der Wasserstoffbrückenbindungen enthält. </li><li> Analysieren Sie visuell den oberen 25% der erzielte Posen für 1) superimposability mit dem bekannten Capping-Gruppe (mit einer relativen mittlere quadratische Abweichung (RMSD) Wert von weniger als 2 a), 2) erfüllt Interaktion Filter und 3) visuelle Komplementarität mit dem Cyclin Nut . Es wird angenommen, daß ein korrekt angedockt darstellen (im Vergleich zu einem experimentellen Aufbau) eine RMSD-Wert von &lt;2 A. </li><li> Untersuchen Posen für visuelle Komplementarität, die als mit effizienten Füllung der Bindungstasche in einer Weise, die mit bekannten Struktur-Wirkungsbeziehungen ist definiert ist. Interaktion Filter sind so eingestellt, Atom Beschränkungen, die intermolekularen Kontakte bekannt kritisch für die Bindung und / oder sind erforderlich, um das Potenzial Capping-Gruppe in die richtige Geometrie für Amidbindungsbildung positionieren zu sein erfordern. Drei Beispiele für angedockt Posen der potentielle N-Verkappungsgruppen machen Wasserstoffbrücken mit Zusan Filter werden in 4 gezeigt. </li></ol></li></ol> 2. Synthese und Charakterisierung von potentiellen N -capping Gruppen <ol start="1"><li> Synthese von N-Verkappungsgruppen. </li><li> Für die Synthese, verwenden alle kommerziellen Ausgangsmaterialien, Lösungsmittel und Reagenzien, wie erhalten. Synthetisieren potentielle N-Verkappungsgruppen mit herkömmlichen organischen Synthesechemie (Figur 5 12,13 für ein Beispiel). </li><li> Zuführen Dünnschichtchromatographie (TLC) auf Kieselgel zum Überwachen Reaktionen. <ol><li> Löse das Ausgangsmaterial und die Reaktionsmischung (1 mg) in der mobilen Phase und vor Ort sie auf der DC-Platte unter Verwendung von Kapillaren. </li><li> Legen Sie die DC-Platte in der Kammer enthält, mobile Phase (Ethylacetat und Hexan in einem 35:65 Verhältnis). Sobald die mobile Phase 90% der DC-Platte erreicht, zu entfernen und an der Luft trocknen Sie die Platte. </li><li> Verwenden Sie UV-Licht auf das Ausgangsmaterial und Reaktionsmischungen als sichtbare Flecken zu erkennen. Calculate die R f aller Punkte (Verhältnis der Entfernung von der Stelle und der mobilen Phase gereist). Anmerkung: Die Reaktion ist beendet, wenn kein Punkt an der R f des Ausgangsmaterials gesehen. </li></ol></li><li> Nach der Vollendung der Reaktion Aufarbeitung des Reaktionsgemisches, indem in einem Scheidetrichter und Waschen mit wässrigen Säure- oder Basenlösung entsprechend. Sammeln des organischen Lösungsmittels verdampft es in einem Rotationsverdampfer und Trocknen des Rohproduktes im Vakuum erhalten. </li><li> Man löst 500 mg Rohprodukt in 3-5 ml geeigneten Lösungsmittel, und fügen Sie zu einer 1 g Kieselsäure oder RP18 Samplet und unter Luft trocknen. Legen Sie die Samplet enthält das rohe Produkt in den Silica / RP SNAP Flash-Kartuschen und das rohe Material mit automatisierten Hochleistungs Flash-Chromatographie (nach Herstellerprotokoll) unter Verwendung eines SNAP 100 g Säule mit einem Gradienten Lauf ausgehend von 6% Ethylacetat: 94 % Hexan bis 50% Ethylacetat und 50% Hexan als15 Säulenvolumina. </li><li> Trocknen des gereinigten Produkts mit einem Rotationsverdampfer in einem Lösungsmittel aus dem Flash-Chromatographie gesammelten durch Verdampfen das gesamte Lösungsmittel zur Trockene und das Produkt weiter unter Vakuum getrocknet, um alle Restlösungsmittel zu entfernen. Zuführen Charakterisierung des gereinigten Produkts durch NMR, MS und analytische HPLC. <ol><li> 1 H-NMR und 13 C-NMR, ein Gewicht von etwa 10 mg des gereinigten Probe, löst ihn in einer entsprechenden deuterierten Lösungsmittel und der Inhalt in einem trockenen NMR-Röhrchen für die Aufnahme der NMR-Spektren 2,14. </li><li> Notieren Sie die 1 H-NMR und 13 C-NMR-Spektren mit hoher Feld NMR-Spektrometer (mindestens 300 MHz). Erwerben Massenspektren mit einer QTOF (Tandem Vierfach-1-Flugzeit-Massenspektrometer), Elektrospray-Ionisation (ESI) oder einem VG-70S (Doppelfokus-Magnetsektor-Massenspektrometer, EI) 2,14. </li><li> Analyse der Reinheit der Produkte durch HPLC mit Diodenarray-Detektor und ausgestattet mitein C18 (2) 100 A, 250 × 4,6 mm, 5 &amp; mgr; m-Säule für die Analyse. Verwenden Sie einen Farbverlauf Lauf ausgehend von 100% Wasser (0,1% Trifluoressigsäure) auf 60% Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure) über 30 Minuten und halten Sie den Farbverlauf für 4 min. Extrahieren Sie die Chromatogramme bei 226 und 254 nm 2,14. Anmerkung: Analytical Reinheiten ausgewertet Verbindungen waren&gt; 95%. </li></ol></li></ol> 3. Festphasensynthese zur Erzeugung von FLIPs 2 <ol start="1"><li> Synthese von N-capped FLIPs <ol><li> Montieren N bedeckten Peptidverbindungen durch Standard-Festphasen-Syntheseverfahren mit den folgenden Schritten. <ol><li> Aktivieren 5 Äquivalente der C-terminalen Aminosäure (Fmoc-Phe) in 4,4 Äquivalenten O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; N&#39;-tetramethyluroniumhexafluorphosphat-Hexafluor-phosphat (HBTU, 221.93 mg) in 2 ml DMF für 5 min. Laden Sie die Fmoc-Phe HBTU Mischung auf die Rink-Harz mit 6 Äquivalenten Diisopropylethylamin (DIPEA, 103,13mg) für 1 h bei RT. </li><li> Entfernen der Fmoc-Schutzgruppe von der C-terminalen Rest mit 20% Piperidin in 3 ml DMF für 10 min. Paar nachfolgenden Aminosäuren (beispielsweise Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) Schritt für Schritt. Bei jedem Schritt Paar 5 Äquiv der nächsten Aminosäure mit 6 Äquivalenten DIPEA (103,13 mg) und 4.4 Äquivalenten HBTU (221.93 mg) in 2 ml DMF 1 Stunde bei RT. </li><li> Gelten Waschzyklen (5 x 10 ml DMF + 5 x 10 ml DCM) Nach der oben beschriebenen Aminosäure-Kupplung und Fmoc Entschützungsschritte. Nach der Peptidanordnung Paar N-Verkappungsgruppen mit 6 Äquivalenten DIPEA (103,13 mg) und 4.4 Äquivalenten HBTU (221.93 mg) in 2 ml DMF 1 Stunde bei RT. </li><li> Nach Abschluss der Peptidsynthese, Behandlung des Reaktionsgemisches mit 2 ml der Abspaltungsmischung (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N Seitenkettenschutzgruppen zu entfernen, und spalten Flips von dem Harz. Verreiben des resultierenden Produkts mit kaltem Diethylether ausgefällt und if erforderlichen Konzentrat in einem Rotationsverdampfer. </li></ol></li></ol></li><li> Synthese von N-capped-C bedeckten FLIPs <ol><li> Wiegen und lösen Sie die N-terminal verschlossen und geschützt Arg-Leu-Peptid (16,1 mg, 0,02 mmol) in Dichlormethan, und fügen Sie [4- (3-Chlorphenoxy) pyridin-2-yl] methan (C-Cap) zusammen mit O - Benzotriazol-N, N, N &#39;, N&#39; N&#39;-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) und N, N-Diisopropylethylamin (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol). </li><li> Rühren und Überwachung der Reaktion bei RT, bis die TLC / HPLC zeigt den vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials. Nach der Beendigung der Reaktion konzentriert man das rohe Reaktionsgemisch mit einem Rotationsverdampfer und dann zwischen Ethylacetat und Wasser. </li><li> Trenne die wässrige und organische Schicht; die organische Phase wird mit 1 N NaOH, 1 N HCl und Kochsalzlösung. Trocknen der organischen Schicht mit etwa 1 g Natriumsulfat und konzentriert, um ein Produkt in einem Rotationsverdampfer. Finally Das Produkt O / N mit dem Spaltungsgemisch (95: 2,5: 2,5 Trifluoressigsäure / H 2 O / TIPS) zur Entfernung der Schutzgruppe. </li><li> Verreiben des resultierenden Produkts mit kaltem Diethylether und gegebenenfalls Konzentrat in Rotationsverdampfer zur Trockene, um das gesamte Lösungsmittel zu entfernen abzuschließen. Das Produkt weiter zu trocknen unter Vakuum, um alle Restlösemittel zu entfernen. </li></ol></li><li> Reinigung und Charakterisierung von FLIPs <ol><li> Reinige rohe FLIPs mit halb präparative Umkehrphasen-HPLC-Verfahren. Lyophilisieren die gereinigten Flips und charakterisieren ihre Molekülmasse unter Verwendung von Massenspektrometrie 2,14. </li><li> Bestimmung der analytischen Reinheit der FLIPs durch HPLC mit einem Diodenarray-Detektor und mit einem C18 (2) 100 A ausgestattet ist, 250 x 4,6 mm, 5 &amp; mgr; m-Säule. Verwenden ein Gradientenverfahren hend von 95% H 2 O (0,1% Trifluoressigsäure) / 5% Acetonitril (0,1% Trifluoressigsäure) auf 35% H 2 O (0,1% Trifluoressigsäure) / 65% Acetonitril (0,1% trifluoroacetic Säure) über 30 Minuten und halten Sie den Farbverlauf für 4 min. Extract Chromatogramme bei 226 und 254 nm. </li></ol></li></ol> 4. Fluoreszenzpolarisation Binding Assay zur Bestimmung der kompetitiven Bindung 2,14 <ol start="1"><li> Führen Sie den Test in schwarzen 384-Loch (138 ul) Platten mit dem folgenden Verfahren. </li><li> Verdünnen der Proben Tracer Peptide (4 nM) und Kinasekomplexe (CDK2 / Cyclin-A - 18 &amp; mgr; g / ml, CDK4 / Cyclin D - 37 ug / ml) zur erforderlichen Konzentrationen in Testpuffer (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM Dithiothreitol (DTT). </li><li> Zu jeder Vertiefung der 384-Well-Platte, hinzuzufügen: 5 ul CDK4D1 oder CDK2CA (0,3 ug / Vertiefung gereinigten rekombinanten humanen Kinase-Komplex), 5 ul Verbindungslösung, 5 ul 30 nM Tracer-Peptid (Fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly oder Fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly-Tracer-Peptid). Verwenden 5 ul jeder DMSO (6%), buffer, Tracer und 5 ul DMSO (6%), Kinase-Komplex, Tracer als Kontrollvertiefungen </li><li> Nach der Zugabe der alle Komponenten, zentrifugieren Sie die Platte bei 500 UpM für 1 Minute (41,16 · g) bei RT und dann inkubieren Sie die Platte unter Rühren für 45 min bei RT. Mit Hilfe eines Multimode-Plattenlesegerät und Detektor mit 485 nm / 535 nm Anregungs- / Emissionsfilter und einem dichroitischen Spiegel ausgestattet lesen Sie die Fluorescein Intensität jeder Vertiefung in der Platte. </li><li> Berechnung der relativen mittleren Polarisation (mp) für alle Testproben unter Verwendung der unten stehenden Gleichung zeigt. Bestimmen Sie IC 50 -Werte durch logarithmische Regression durch Korrelation gegen mps und Testkonzentrationen. </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI&#8217;s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and...

In diesem Artikel wird eine Fallstudie über die Anwendung des REPLACE (Replacement mit Teilliganden Alternativen mit Rechen Anreicherung) Strategie, peptidische Inhibitoren der Protein-Protein-Interaktionen in mehreren pharmazeutisch relevanter Moleküle umzuwandeln beschrieben 1-3. Während EPI stellen eine reiche, aber wenig genutzt Quelle potentieller Wirkstoff-Targets werden bestehende Methoden weitgehend unzureichenden diese allgemein zugänglich zu machen. Aktuelle Strategien einschließlich Fragment basierte Entwurf 4, Hochdurchsatzscreening 5 und 6 geheftet Peptide haben Fortschritte vorgesehen, aber diese sind in vielen Fällen unwirksam. Als Ergebnis werden mehr Fortschritte und effizienter Ansätze erforderlich. REPLACE ist vollständig in der Entwicklung von Kinase-Inhibitoren, die arzneimittelähnliche verbesserte Eigenschaften haben und Entwicklungspotential als Antitumortherapeutika validiert. Diese Strategie ist in der Entwicklung von nicht-ATP Inhibitoren der Zell exemplifiziertZyklus CDKs und umfasst: 1) Erhalten von 3D Strukturinformationen über die Wechselwirkungen HAKRRLIF / RRLIF mit Cyclin-Bindungsfurche; 2) Bestimmung der wichtigsten Bindungsdeterminanten für Peptid-Wechselwirkung; 3) Verkürzung des Peptids N-Terminus enthält, eine oder mehrere Bindungsfaktoren; 4) rechnerische Ermittlung potentieller kleines Molekül Alternativen (partielle Ligand Alternativen PLAs) für den kegelstumpfförmigen Teil des Peptids und dem Bindung wichtiger Wechselwirkungen des Stammpeptids; 5) Synthese oder gewerblichen Beschaffung von PLAs vorausgesagt, um eifrig mit dem Unter Website zuvor von der gelöscht Peptidrest (n) besetzt binden; 6) Synthese von blättert durch Ligation der besten PLAs, um das verkürzte Peptid unter Verwendung der Festphasensynthese; 7) Test des FLIPs in einem In-vitro-Bindung oder funktionelle Assays (Fluoreszenzpolarisation in der CDK / Cyclin-Kontext), gefolgt von weiteren Charakterisierung in einem Zelllebensfähigkeitstest. Eine schematische Darstellung strateg REPLACEy ist in Figur 1 dargestellt ist. In diesem Artikel werden die Iterationen des REPLACE-Strategie diskutiert und die Anwendung auf CDK2 / Cyclin A im Detail beschrieben. CDKs wird angenommen, dass in der Mehrzahl der Tumoren direkt oder indirekt dereguliert werden und sind daher geeignete Krebs-Medikament Ziele 7 betrachtet. CDKs erfordern Zusammenarbeit mit Cycline für die vollständige Aktivierung und anschließend phosphoryliert Schlüsselproteine ​​in der Zellzyklusregulation 8 beteiligt. Die zwei Hauptgruppen von CDKs sind die Isotypen, die Zellzyklus-Checkpoints kontrollieren [G1 / S (CDK4 / Cyclin D, CDK6 / Cyclin D und CDK4 / Cyclin E), S-Phase (CDK2 / Cyclin A) und G2 / M (CDK1 / Cyclin B)], und die Aufsichtsbehörden der RNA-Polymerase durch Phosphorylierung (CDK7 / Cyclin H, CDK8 / Cyclin C, CDK9 / Cyclin-T). Ein Schlüsselschritt in der S-Phase auftritt, wenn der Fort E2F1 Transkriptionsfaktor einen Komplex mit dem DP-Protein, das eine Bindung mit DNA und initiiert Gentranskription bildet. CDK2 / Cyclin A erforderlich ist, um E2F1 Transkriptions neutralisierenAktivität durch Phosphorylierung wodurch die zu der E2F1-DP-Komplex und dessen nachfolgenden Abbau freigeben. Die Hemmung von CDK2 / Cyclin A wird angenommen, dass E2F1 in seiner DNA-gebundenen Zustand anhaltender Aktivierung führt zu halten. Die sich ergebende Niveau von E2F-1-Aktivität wird die erforderlich ist, um p53 unabhängige Apoptose zu induzieren, damit was auf eine therapeutische Strategie Schwelle zu übertreffen. Aufgrund dereguliert p53 und pRb Wegen hohe E2F-1 häufig in Krebszellen und Inhibierung von CDK2 / Cyclin A auftreten sollten, um eine selektive Apoptose in Tumoren führen und kann als validiert Krebs-Target 7 betrachtet werden. Klinisch untersucht CDK-Inhibitoren zielen auf den hoch konservierten ATP-Bindungsstelle, die zu Reaktivität unter den mehr als 500 Proteinkinasen im menschlichen Kinoms überqueren und möglicherweise, die zu Wirkungen und Toxizität 9 Seite. Ein alternativer Ansatz ist nicht-ATP-kompetitive Hemmung durch gezielte Substrat Rekrutierung durch die CBGauf Cyclin positive regulatorische Untereinheit vorhanden ist und die daher unterschiedliche und weit entfernt von ATP-Bindungsstelle 10,11 ist. Das CBG ist hauptsächlich eine hydrophobe Rille in Cyclin A, Cyclin D und Cyclin E vorhanden und es wurde gezeigt, um eine Konsensus-Sequenz in Substraten und Tumorsuppressoren gefunden erkennen. Als ein isoliertes Peptid, das Cyclin-Bindungsmotiv (CBM) bindet an das CBG und wurde gezeigt, dass die Kinaseaktivität der Zellzyklus-CDKs inhibieren. Das CBM wurde Octapeptids optimiert (HAKRRLIF, CDK2 / Cyclin A IC 50 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / Cyclin D, IC 50 0,88 ± 0,34 uM) und außerdem an einen trunkierten Pentapeptid repräsentiert einen guten Kompromiss zwischen dem Molekulargewicht für Drogen- Gleichheit und Potenz (RRLIF, CDK2 / Cyclin A IC 50 1,01 ± 0,17 &amp; mgr; M, CDK4 / Cyclin D, IC 50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. Die CBGs bestehen aus einer großen primären und sekundären kleinere hydrophobe Tasche, die durch eine acidi überbrückt werdenc Bereich (beinhaltet Glu220, Glu224 und Asp283). Die wichtigsten Bindungsdeterminanten HAKRRLIF beinhalten die Wechselwirkung von Ala2 mit den sekundären hydrophoben Tasche, Ionenpaarung und Wasserstoffbrückenbindungen Lys3, Arg 4 und arg5 mit dem sauren Bereich und einem hohen Grad an Komplementarität Leu6 und Phe8 mit dem primären lipophilen Ort. Darüber hinaus werden zahlreiche Wasserstoff-Bindungen vom Peptid-Rückgrat beigetragen während Ile7 wirkt als ein Abstandshalter-Rest ermöglicht einen optimalen Kontakt mit dem primären Tasche. Das Bindungsmotiv und Wechselwirkungen HAKRRLIF mit CBG ist in Abbildung 2 dargestellt. Zur Förderung der CBM / CBG Protein-Protein-Wechselwirkung, wobei die Kinase-Aktivität von CDK2 / Cyclin A, CDK2 / Cyclin E &amp; CDK4 / Cyclin-D zu hemmen, und dies sollte E2F1 auslösen vermittelte Apoptose von Krebszellen, während nicht normale Zellen 7 zu beeinträchtigen. Obwohl CBM abgeleitete Peptide sind wirksame Inhibitoren der CDKs beeinflussen, ist es unwahrscheinlich, dass sie als Arzneimittel nützlich sein, die aufgrund ihrer StoffwechselInstabilität und allgemeiner Mangel an Zellpermeabilität. Zu diesem Zweck haben wir die REPLACE-Strategie, um diese potenten peptidischen Inhibitoren in mehrere wirkstoffähnlichen Verbindungen für die weitere Entwicklung der Anti-Tumor-Therapeutika Ausnutzung dereguliert E2F1 durch CDK2 / Cyclin-A-Hemmung zu konvertieren angewendet. Das folgende Protokoll fasst Arbeit, die bei der Anwendung ersetzen, um die Cyclin Nutfertigung. Im ersten Fall wurden arzneimittelähnliche Cappinggruppe Ersatz für die N-terminale Tetrapeptid der HAKRRLIF identifiziert. Darüber hinaus Verbesserungen in diesen Gruppen wurden in einem zusätzlichen Validierungsstudie für REPLACE sucht. Repräsentative Ergebnisse aus diesen Studien werden ebenfalls vorgestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Computational Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Optiplex Workstations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Organic Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5&#956;m column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Polarization Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 micro well plates, ,&#160; Micro pipets,&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-one</td>
			<td>110256602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)</td>
			<td>BPS Bio Sciences</td>
			<td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 nM HEPES</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>375368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>N3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector&#160; fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, &#160;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP,&#160; MTT reagent,</td>
			<td colspan="2">Fisher, Life technology, Alfa Aesar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Heamocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo electron corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4-8C</td>
			<td>Isotemp Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter.</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors

REPLACE ist eine einzigartige Strategie entwickelt, um zielgerichteter Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI). Es zielt auf verfügbare Medikament Zielraum durch eine verbesserte Methode für die Identifizierung von Inhibitoren für solche Bindungsstellen und die sich ausdehnen stellen die Mehrheit potentieller Arzneimittelziele. Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, einen methodischen Überblick über die Nutzung und Anwendung des REPLACE-Strategie, die Rechen- und Synthesechemie Ansätze beinhaltet bereitzustellen. REPLACE ist durch seine Anwendung auf die Entwicklung von nicht-ATP Wettbewerbs Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK) Inhibitoren als anti-Tumor Therapeutika, beispielhaft dargestellt. CDKs werden häufig in der Krebs dereguliert und damit als wichtige Ziele für die Medikamentenentwicklung berücksichtigt. Inhibition von CDK2 / Cyclin A in der S-Phase ist berichtet worden, um eine selektive Apoptose von Krebszellen in einem p53-unabhängigen Weise durch die E2F1 Wegs zu fördern. Targeting die Protein-Protein-Wechselwirkung an der Cyclin Binding Nut (CBG) ist ein Ansatz, der die spezifische Hemmung des Zellzyklus über Transkriptions CDKs ermöglichen wird. Die CBG wird durch eine Konsensus-Sequenz von CDK Substrate und Tumor-Suppressor-Proteine ​​abgeleitet anerkannt bezeichnet das Cyclin-Bindungsmotiv (CBM). Die CBM hat bereits zu einem Octapeptid aus p21Waf (HAKRRIF) und dann weiter auf ein Pentapeptid Beibehaltung ausreichender Aktivität (RRLIF) abgeschnitten optimiert. Peptide sind im allgemeinen nicht zelldurchlässig ist, metabolisch instabil und damit die REPLACE (Ersetzen mit seitlichem Ligand Alternativen durch Computational Enrichment) Strategie, um mehr arzneimittelähnliche Inhibitoren erzeugen angewendet. Die Strategie beginnt mit der Konstruktion Fragment ligiert inhibitorischen Peptide (FLIPs), die selektiv Zellzyklus CDK / Cyclin-Komplexe hemmen. FLIPs wurden durch iterative Ersetzen von Resten von HAKRRLIF / RRLIF mit Fragment wie kleine Moleküle (Verkappungsgruppen), ausgehend vom N-Terminus (Ncaps) erzeugt, gefolgt von Ersatz fürder C-Terminus. Diese Verbindungen sind Ausgangspunkt für die Erzeugung von nicht-ATP Wettbewerbs CDK-Inhibitoren als anti-Tumor Therapeutika.

Die Wechselwirkungen von HAKRRLIF mit Cyclin Nut sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Peptid-Reste, die die wichtigsten Bindungsdeterminanten dar umfassen Ala2, Arg4, Leu6 und Phe8 mit anderen Resten Bereitstellen kleinere Beiträge 12,13,18. In dieser Fallstudie die REPLACE-Strategie hat, um Fragment Alternativen für Rückstände in der N-terminalen Tetrapeptid der HAKRRLIF, in erster Linie imitiert die Wechselwirkungen von Ala2 und Arg4 finden verwendet worden. Eine Bibliothek potentieller...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors at JoV

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Entwicklung von Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch REPLACE: Anwendung auf die Konzeption und Entwicklung Nicht ATP Competitive CDK-Inhibitoren

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

development-inhibitors-protein-protein-interactions-through-replace

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Aufrufe.  University of South Carolina. We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Serie: Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

Die Verwendung von SC1 (Pluripotin) zu MESC Self-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF-Support

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Forschung

Biologie

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Entwurf und Entwicklung von Aptamer-Gold-Nanopartikeln basierte kolorimetrische Assays für In-the-Feld-Anwendungen

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

Entfernen von exogenen Materialien aus dem äußeren Teil der gefrorenen Kerne der Antike biologische Gemeinschaften beherbergte Innen zur Untersuchung

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Application of Ultrasound and Shear Wave Elastography Imaging in a Rat Model of NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat accumulation (steatosis) and inflammation leading to fibrosis. Preclinical models closely recapitulating human NASH/NAFLD are essential in drug development. While liver biopsy is currently the gold standard for measuring NAFLD/NASH progression and diagnosis in the clinic, in the preclinical space, either collection of whole liver samples at multiple timepoints during a study or biopsy of liver is needed for histological analysis to assess the disease stage.
Conducting a liver biopsy mid-study is an invasive and labor-intensive procedure, and collecting liver samples to assess disease level increases the number of research animals needed for a study. Thus, there is a need for a reliable, translatable, non-invasive imaging biomarker to detect NASH/NAFLD in these preclinical models. Non-invasive ultrasound-based B-mode images and Shear Wave Elastography (SWE) can be used to measure steatosis as well as liver fibrosis. To assess the utility of SWE in preclinical rodent models of NASH, animals were placed on a pro-NASH diet&#160;and underwent non-invasive ultrasound B-mode and shear wave elastography imaging to measure hepatorenal (HR) index and liver elasticity, measuring progression of both liver fat accumulation and tissue stiffness, respectively, at multiple time points over the course of a given NAFLD/NASH study.
The HR index and elasticity numbers were compared to histological markers of steatosis and fibrosis. The results showed strong correlation between the HR index and percentage of Oil Red O (ORO) staining, as well as between elasticity and Picro-Sirius Red (PSR) staining of livers. The strong correlation between classic ex vivo methods and in vivo imaging results provides evidence that shear wave elastography/ultrasound-based imaging can be used to assess disease phenotype and progression in a preclinical model of NAFLD/NASH.

This protocol describes the use of an enhanced ultrasound technique to non-invasively observe and quantify liver tissue changes in rodent models of nonalcoholic fatty liver disease.

Anwendung von Ultraschall- und Scherwellen-Elastographie-Bildgebung in einem Rattenmodell von NAFLD / NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat ...