Die Autoren möchten die GWU Harlan Fellowship für die Unterstützung von Paaqua Grant und der GWU Luther Reis Fellowship für die Unterstützung von Mona Herold anzuerkennen. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation MCB-1121711 unterstützt.

Ein. Vorbereitung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Schärfen vier Zangenelemente mit Alumina Schleiffolie. Tun Sie dies unter einem Binokular, um die Größe der Spitze zu überwachen. Eine Zange dient als ein Back-up für den Fall einer Spitze wird während des Verfahrens geschädigt. Autoklavieren alle vier Zangen und lagern in einem sterilen Behälter. </li><li> Stellen Sie 500 ml jeweils 0,1 X und 1,0 X Kulturmedium (entweder Marcs Modified Ringers [MMR] oder Modified Barths Saline [MBS]; Rezepten in 15) und Filter zu sterilisieren. Wir verwenden routinemäßig MBS (1X = 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO 3). Lagerung bei 14-18 ° C für Monate. </li><li> Einen 2% Agaroselösung in Kulturmedium (2 g Agarose-Elektrophorese Grade in 100 ml 1X Kulturmedium in einer Schraubkappe Glasflasche). Autoklavieren eine Agarose aufzulösen. Dies kann bei 4 ° C über Monate gelagert werden, und der Mikrowelle, um die Agarose zu verflüssigen, wenn es weiter erforderlich ist. </li><li> Während die Agarose flüssig ist, gießen etwa 0,5 ml auf den Boden jeder Vertiefung einer sterilen 24-Well-Kulturplatte. Dadurch werden die Explantate vom Kleben an der Kunststoff verhindern. </li><li> Während die Agarose flüssig ist, gießen Sie etwa 2-3 ml auf den Boden von zwei bis drei 60 mm Petrischalen und behutsam schwenken, um sicherzustellen, dass der Boden bedeckt ist. Diese werden als Dissektion Gerichte servieren und die Agarose verhindert Embryonen aus Festhalten an der Kunststoff einmal ihre Membranen entfernt werden. </li><li> Wenn die Agarose wurde abgekühlt und ausgehärtet, Flamme die Spitze eines 6 &quot;Pasteurpipette bis es schmilzt zu einer Kugel, leicht berühren und ihn auf der Oberfläche der Agarose in jede Vertiefung der Kulturplatte. Dadurch wird eine flache Vertiefung schaffen, in die das Explantat platziert wird. </li><li> Füllen Sie jedes Well der Kulturschale mit 1X sterile Kulturmedium. </li><li> Wenn die Agarose abgekühlt und ausgehärtet ist, füllen die Dissektion Schale mit verdünnter Kulturmedium (0,1 x MMR oder 0,1 x MBS) an Blastomeren Trennung zu erleichtern. </li&gt; </ol> 2. Selektion von Embryonen <ol><li> Erhalten befruchteten Eier und entfernen Sie das Gelee Mäntel nach Standardprotokollen 15. Übertragen auf 0,5 X Kulturmedium in einer 100 mm Petrischale. </li><li> Wenn die Embryonen 2-Zellen-Stadium erreichen, zu sortieren, in denen der erste Teilungsfurche halbiert den leicht pigmentiert Bereich in dem Tier Halbkugel (Abbildung 1) in einem separaten Teller. Diese werden die Geber für die Explantate sein. Halten Sie die verbleibenden 2-Zell-Embryonen in einem separaten Teller neben den Spenderembryonen während des gesamten Verfahrens als Geschwister Kontrollen dienen dazu, die Explantate zu inszenieren. </li></ol> 3. Herstellung Explantate <ol><li> Zeigen 5-10 Embryonen in einer Dissektion Gericht, aber nur auf einer Embryos gleichzeitig arbeiten. </li><li> Positionieren des ersten Embryo, so dass die transparente Dotterhaut ersichtlich, es ist durch einen freien Bereich (perivitellinen Raum) über der Oberfläche des Tieres Pol des Embryos getrennt. Mit einem geschärften Kraftps in einem der Subdominante Hand (linke Hand, wenn man rechts übergeben), fassen Sie die Dotterhaut über dem perivitellinen Raum. Verwendung einer geschärften Pinzette in der anderen Hand die Membran dicht an dem ersten Zange Spitze, und sanft in entgegengesetzten Richtungen ziehen, um die Membran Schale entfernt. Machen den anfänglichen Griff in einem Abstand von der Zelle, die zu seziert werden, so dass die Zielzelle nicht während der Entfernung der Membran beschädigt wird. Man kann sagen, dass die Membran entfernt wurde, weil der Embryo zu glätten. </li><li> Schnappen Sie eine Nachbarzelle mit der Zange in der Subdominante Hand und diese Zelle als &quot;Griff&quot;, so die Zelle zerlegt werden nicht direkt berührt. Mit der Zange in der anderen Hand, ziehen die verbleibenden benachbarten Zellen weg von der gewünschten Blastomere. Wenn Mittellinie Zellen, die das gleiche Schicksal teilen, ausgerichtet sind, können sie als Paar zusammen entfernt werden. Schließlich sezieren entfernt den &quot;Griff&quot; Zelle. </li><li> Nehmen Sie den Blastomeren (oder Blastomeren Paar), mit einem sterilen, Glas Pasteurpipette luftblasenfrei und übermäßige Absaugung. Die Pipette kann feuerpolierte um scharfe Kanten, die die Zelle schädigen können zu entfernen, aber wir wissen nicht routinemäßig tun. Setzen Sie die Spitze des Pasteurpipette unter der Oberfläche des Kulturmediums in einer Vertiefung der Explantat Kulturschale und sanft vertreiben die Blastomeren. Es sollte in der flachen Mulde durch die Schwerkraft gleiten. Dasselbe Blastomere aus mehr als einem Embryo kann in einem einzigen Explantat kombiniert werden. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen Embryonen bei der Dissektion Gericht, one-by-one. Nach etwa 10 Embryonen, wird die Dissektion Gericht mit Zelltrümmern gefüllt werden. Wenn dies auftritt, in ein frisches Dissektion Schale zu verändern. </li><li> Nachdem alle Sektionen fertig sind, überprüfen, ob die Explantate in den flachen Vertiefungen sind. Wenn nicht, können sie leicht in die Vertiefung werden mit einem Haar-Schleife, die in 70% Ethanol und luftgetrocknet wurde sterilisiert geschoben. </li><li> Etwa eine Stunde nach der letzten Dissektion, entfernen Sie Schmutz surrounden die geheilt Explantate mit einer sterilen, Glas Pasteur Pipette. </li><li> Kultur die Platte von Explantaten bei 14-20 ° C neben dem Petrischale mit den Geschwistern, Kontrolle Embryonen. Sibling Embryonen zeigt den Stand der Entwicklung der Blastomeren Explantate. </li></ol> 4. Harvesting Explantate für die Analyse <ol><li> Ernten Sie die Explantate, wenn die Geschwister die gewünschte Entwicklungsstadium erreichen. Diese Explantate überleben recht gut, selbst wenn einige der Zellen zerfallen. Deshalb, wenn es eine trübe Masse auch in der Kultur, erkunden es mit einem Haar-Schleife oder einer Zange, um zu bestimmen, wenn ein gesunder Explantat innerhalb begraben ist. </li><li> Abzuholen Explantate in einem kleinen Volumen von Kultur-Lösung mit einer Pasteurpipette aus Glas, und sanft auszustoßen sie in einem Fixiermittel oder Lysepuffer entsprechenden für den Assay durchgeführt werden. </li></ol>

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	<li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis.">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li><li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo.">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus.">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li><li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways.">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li><li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus.">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos.">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li><li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo.">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus.">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li><li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li><li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos.">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Kultivierung der einzelnen Blastomeren sind: 1) korrekt identifiziert die Blastomeren von Interesse; 2) die Aufrechterhaltung einer sterilen, gesunde Kultur, 3) Sezieren Zellen an der richtigen Teil des Zellzyklus und 4) die Entwicklung der notwendigen manuellen Fingerfertigkeit, um Schäden während der Präparation zu verhindern und Transfer zum Kultur gut. Um bestimmte Blastomeren zu manipulieren, ist es wichtig, in der Lage sein, um die Hau...

Xenopus laevis Embryonen wurden ausführlich die Mechanismen, durch die embryonalen Zellen erhalten ihre spezifische Schicksal, weil ihre Eier groß genug, um mikrochirurgische Ansätze erlauben identifizieren genutzt. Zusätzlich entwickeln sie extern ohne Nahrungsergänzung des Kulturmediums weil jede Zelle enthält einen reichen intrazellulären Zufuhr von Eigelb Blutplättchen, die eine intrinsische Energiespeicher bereitzustellen. Ein wichtiges Asset für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen das Schicksal der Zelle bestimmt wird, ist die umfassende Reihe von Schicksal Karten der Spaltung der Bühne Blastomeren (von 2 - bis 32-Zell-Stadium) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Diese Karten wurden durch Mikroinjektion ein detektierbares Molekül in eine einzige, identifizierbare Blastomere und Überwachen später in der Entwicklung, welches Gewebe durch das markierte Nachkommen bestückt sind konstruiert. Konsequente Schicksal Karten sind möglich, da die Hauptachsen der Embryonen zuverlässig in vielen embry identifiziert werdenos. Erstens, in allen Wildtyp Embryonen das Tier Hemisphäre ist pigmentiert, während die pflanzlichen Hemisphäre ist es nicht. Zweitens verursacht der Eintrag der Spermien bei der Befruchtung einer Kontraktion des Tieres Halbkugel Pigmentierung Richtung Zukunft Bauchseite, in vielen Embryonen eine Pigmentierung Unterschied daher kann zwischen dorsalen und ventralen Seiten diskriminieren. Dritte, nähert sich die erste Teilungsfurche Mitte der Sagittalebene in den meisten Embryonen und somit verwendet werden können, um die rechte und linke Seite des Embryos zu identifizieren. Das Schicksal Karten stützen sich auch auf die Tatsache, dass natürlich befruchtete Eier häufig spalten in regelmäßigen Mustern, die jeweils Blastomeren identifizierbaren über eine große Population von Embryonen zu machen. Während es Variabilität innerhalb und zwischen Gelege bezüglich Pigmentierung und Spaltmuster mit Auswahlverfahren hierin beschriebenen Zellen ermöglicht vorgeschriebener Schicksalen um mit etwa 90% Genauigkeit identifiziert werden. Zellschicksale kann abzuschreckenabgebaut während der Embryogenese durch verschiedene Mechanismen. Intrinsische Faktoren wie differentiell geerbt cytoplasmatischen mRNAs oder Proteine, um verschiedene Aspekte der frühen Strukturieren beitragen. Beispielsweise bestimmen spezifischen mütterlichen mRNAs, welche Zellen der Keimbahn beitragen, sich das Entoderm, oder dazu beitragen, den dorsalen Körperachse (bewertet in 7). Extrinsische Faktoren lokal von benachbarten Zellen oder entfernter aus einer embryonalen Meldezentrale vorgesehen, sind verantwortlich für die Bildung spezifischer Gewebetypen und Strukturieren fast jedes Organsystem. Beispiele der Signalisierung Zentren gehören die Veranstalter / Knoten in der Gastrula, die neuronalen Ektoderm und Muster das Mesoderm induziert, und die Zone polarisierender Aktivität, dass die Muster der anterior-posterioren Achse des Gliedmaßenknospe. Obwohl das Schicksal Karten identifizieren die Vorläufer der verschiedenen Organe und zeigen die Entwicklungsweg von ihren Nachkommen im normalen Embryo entnommen, können sie nicht zwischen intrinsischen unterscheidenund extrinsische Einflüsse auf den Zellen. Sie haben auch nicht offenbaren die volle Entwicklungspotential einer Zelle, deren Nachkommen zu differenzieren in der komplexen Signalisierung Umfeld des Embryos. Zwei Versuchsansätze kann getestet werden, ob einer Zelle Schicksal durch intrinsische Faktoren bestimmt wird oder anschließend durch äußere Faktoren beeinflusst: 1) Transplantation der Zelle auf eine neuartige Lage im Embryo, oder 2) Entfernen der Zelle aus dem Embryo durch Kultur in gefolgt die Abwesenheit von exogener Signale. Sowohl experimentelle Ansätze wurden in Xenopus machbar, weil die Zellen groß genug, um manuell getrennt werden sollen. Zum Beispiel haben zahlreiche Studien einzelner Zellen aus Embryonen (um Zell-Zell-Wechselwirkungen zu ändern) oder transplantierten Zellen, neue Stellen in Host Embryonen für Schicksal Änderungen (in 7 bewertet, 8, 9) zu testen gelöscht. Darüber hinaus ist die zweite Ansatz von Explantieren kleine Zahl von Zellen, die aus unterschiedlichen Bereichen des Embryos into Kultur zur induktiven Gewebeinteraktionen in Abwesenheit von exogenen Faktoren aufzuklären ist möglich, weil die Zellen des Embryos Xenopus mit einem intrazellulären Nährstoffdepot die Dotter Blutplättchen gefüllt sind. Daher können sie für einige Tage in einem definierten Medium ohne Nährwert Salz oder Wachstumsfaktor Ergänzung des Kulturmediums kultiviert werden. Wir haben diesen Ansatz verwendet zu zeigen, dass dorsalen Tier Blastomeren haben eine autonome Fähigkeit, neuronale und dorsalen mesodermalen Gewebe aufgrund mütterlich vererbten mRNAs 10, 11 zu produzieren, und andere haben gezeigt, dass Mesoderm Spezifikation 32-Zell-Blastomeren beruht sowohl auf intrinsische und extrinsische Informationen 12 . Ein Vorteil der Kultivierung von Zellen als Explantate ist, dass das Medium auch mit definierten Signalisieren Faktoren zu bestimmen, welche Zelle zu Zelle Kommunikationspfad könnte das Schicksal des explantierten Zelle 12, 13, 14 beeinflussen ergänzt werden. Darüber hinaus kann ein injizieren Blastomere prior die Kultur mit mRNA über-express eines Gens, oder mit anti-sense-Oligonukleotide, die Übersetzung von endogenen mRNAs zu verhindern. Diese, Verstärkungs-und Verlust-of-function-Analysen können Moleküle identifizieren, welche für eine autonom ausgedrückt Schicksal erforderlich. Um das Schicksal des Explantats zu analysieren, kann die Identifikation von spezifischen Zelltypen nach Standard Genexpression (zB In-situ-Hybridisierung, RT-PCR) und immuncytochemische Assays durchgeführt werden. Dieses Protokoll bietet eine einfache, aber leistungsstarke Möglichkeit, zwischen innerer und äußerer Mechanismen, wie eine embryonale Zelle in bestimmten Geweben entwickelt Regulierung unterscheiden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Aluminiumoxid Schleiffolie </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-38 </td><td> Course (12 Mikrometer), für größere Reparaturen von Pinzettenspitzen </td></tr><tr><td> Aluminiumoxid Schleiffolie </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-46 </td><td> Medium (3 Mikrometer), für feine Schärfung Pinzettenspitzen </td></tr><tr><td> Aluminiumoxid Schleiffolie </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-54 </td><td> Fein (0,3 Mikrometer), zum Polieren von Pinzettenspitzen </td></tr><tr><td> Pinzetten: Dumont, Dumoxel Biologie Nr. 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td> # 11252-30 </td><td> Diese haben die feinen Spitzen, die nicht brauchen Schärfen beim ersten gekauft. Korrosionsbeständig, so können sieautoklaviert werden. </td></tr><tr><td> Gentamicin-Lösung </td><td> Sigma </td><td> G1397 </td><td> In den mittleren am selben Tag die Nutzung </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

Schicksal Karten, von Abstammungslinie Tracing alle Zellen eines Embryos konstruiert, offenbaren die Gewebe von jeder Zelle des Embryos abstammen. Obwohl das Schicksal Karten sehr nützlich sind für die Identifizierung der Vorläufer eines Organs und zur Erläuterung der Entwicklungsweg, mit denen die Nachkommen Zellen bevölkern dieses Organs im normalen Embryo, sie nicht zeigen, das volle Entwicklungspotenzial einer Vorläuferzelle oder Identifizierung der Mechanismen, mit denen sein Schicksal bestimmt. Um das Schicksal der Zelle Engagement testen, vergleicht man einer Zelle normalen Repertoire von Nachkommen im intakten Embryo (das Schicksal Karte) mit denen nach einer experimentellen Manipulation ausgedrückt. Wird die Zelle Schicksal fixiert (gebunden), unabhängig von der umgebenden zellulären Umgebung, oder ist es durch externe Faktoren von seinen Nachbarn zur Verfügung gestellt beeinflusst? Mit den umfassenden Schicksal Karten des Xenopus Embryo, beschreiben wir, wie zu identifizieren, zu isolieren und Kultur einzigen Furchungsstadium Vorläufer namens Blastomeres. Dieser Ansatz erlaubt es, festzustellen, ob diese frühen Zellen mit dem Schicksal sie in ihrer normalen Umgebung erwerben im intakten Embryo, erfordern Interaktionen mit ihren Nachbarzellen begangen werden, oder kann auf alternative beeinflusst Schicksale auszudrücken, wenn auf andere Arten von Signalen ausgesetzt werden.

Die Fähigkeit dieses Tests, genau zu beurteilen das Entwicklungspotenzial der Zelle beruht auf sezieren die korrekte Blastomeren über das Schicksal der Basis Karten 1, 2, 3, 4, 5, 6. Daher ist es entscheidend, Embryonen mit der korrekten Pigmentierung Muster an der 2-Zellen-Stadium zu wählen, wie in Abbildung 1, die anschließend entsprechen regelmäßigen Spaltmuster, wie in 2 veranschaulicht dargestellt. Wenn man die sortierten Embryonen beobachtet, wie sie die erforderl...

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Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Das Schicksal einer einzelnen embryonalen Zelle kann durch vererbte Moleküle und / oder durch Signale von benachbarten Zellen beeinflusst werden. Mit Hilfe Schicksal Karten der Spaltung der Bühne Xenopus Embryos können einzelne Blastomeren für Kultur isoliert identifiziert werden, um die Beiträge der ererbten Moleküle gegenüber Zell-Zell-Interaktionen zu beurteilen.

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

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15.2K Aufrufe.  The George Washington University. Das Schicksal einer einzelnen embryonalen Zelle kann durch vererbte Moleküle und / oder durch Signale von benachbarten Zellen beeinflusst werden. Mit Hilfe Schicksal Karten der Spaltung der Bühne Xenopus Embryos können einzelne Blastomeren für Kultur isoliert identifiziert werden, um die Beiträge der ererbten Moleküle gegenüber Zell-Zell-Interaktionen zu beurteilen.

Serie: Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Forschung

Biologie

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark und Track Cells In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...