Die Max-Planck-Gesellschaft und eine Göttinger Graduiertenschule Junior Gruppe Stipendium für HB finanziert diese Arbeit.

1. Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Verwenden Sie ein Mikroskop, das in der Lage, halten die Probe im Mittelpunkt steht und der mit einem automatischen Bühne ausgestattet. Erstellen Sie eine maßgeschneiderte Deckelheizung oder Kommerzielle Lösung. Einrichtung eines LED-EMCCD-Kamera-System, in dem die Belichtung der Kamera löst durch ein TTL-Signal LED-Beleuchtung mit den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Lesen Sie Diskussionen für Details. </li><li> Polydimethylsiloxan (PDMS) Briefmarken: <ol><li> Herstellung PDMS-Stempel in einem Mikrofluidik-Anlage oder die von einem kommerziellen Gießerei produziert PDMS-Stempel. Um Kommerzielle Gießerei nutzen, senden Sie eine AutoCAD-Datei an das Unternehmen und geben Sie die Tiefe (15 &amp; mgr; m, zum Beispiel) des Gerätes. Nach der Lieferung aus der Gießerei, schneiden Sie die PDMS-Chips in ihre 16 Marken mit einem Skalpell. </li><li> Binden jeden einzelnen Stempel auf einem Glasobjektträger mit Luftplasma. Zum Kleben, aussetzen sowohl die PDMS-Stempel und die Objektträger an der Luft-Plasma für einRunde 1 min (mit den höchsten Plasma Einstellungen bei 0,5 mbar). Stellen Sie sicher, dass die Oberflächen für die Verklebung nach oben zeigen während der Plasmabehandlung. Dann legen Sie die PDMS-Stempel auf den Objektträger. </li></ol></li><li> Werfen Sie einen 3,5 cm Bodenschale und schneiden Sie eine quadratische Fläche von 18 x 18 mm von der Mitte der Boden der Schale mit einem Vertikal-Fräsmaschine und scharfe Schneidrollen. Verwenden niedrige Drehgeschwindigkeit des Schneiders und langsamen Vorschub um den Kunststoff vor dem Schmelzen aufgrund der Wärme durch Reibung erzeugt verhindern. Bereiten Sie verschiedene Gerichte auf einmal. Hinweis: Die Bodenschale kann viele Male nach dem Experiment wiederverwendet werden, wenn sie nach dem Einweichen in reinem Ethanol O / N wird gereinigt. </li><li> Agarose: <ol><li> Man löst 3 g hochschmelzender Agarose in 100 ml S-Basal (5,85 g NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g KH 2 PO 4, 1 ml Cholesterin (5 mg / ml in Ethanol), H 2 O auf 1 L, durch Autoklavieren sterilisieren) durch Kochen. Machen Sie Teilmengen der gelösten Agarose in 2 ml Eppendorf-Röhrchen und store. Auch bereiten eine Charge von niedrig schmelzender Agarose genau der gleichen Weise wie die hochschmelzender Agarose. </li><li> Vor der Verwendung legen 3 Teilmengen von hochschmelzenden Agarose auf einen Heizblock bei 95 bis 98 ° C. Vor der Verwendung legen Sie eine aliquote Menge von niedrig schmelzender Agarose auf einem Heizblock bei 95 - 35 ° C - 98 ° C, bis es bei 30 auf einen Thermoblock geschmolzen und dann. </li></ol></li></ol> 2. Auswahl der Tiere <ol><li> Würmer wachsen auf einem niedrigen Dichte auf NGM-Platten ausgesät, um saubere Tiere zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass es reichlich zu essen und nur wenige Tiere auf dem Teller. </li><li> Für die Bildgebung L1-Larven, Transfer ca. 30 Eier enthält Embryonen im Stadium Brezel auf eine frische ausgesät NGM Platte. Für die Übertragung von späteren Larvenstadien oder Erwachsener C. elegans, Transfer ca. 30 Würmern auf eine frische ausgesät NGM Platte. </li></ol> 3. Herstellung von Agarose Mikrokammern <ol><li> Vorbereitung der Schale: <ol><li>Nehmen Sie eine Plastikschale mit einer quadratischen Öffnung von 18 x 18 mm am Boden und legen Sie sie auf den Kopf mit der Öffnung nach oben. Schließen Sie die Öffnung, indem Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband von 20 x 20 mm auf die Öffnung. Drehen Sie den Teller um, so dass das Klebeband auf der Unterseite und die Schale auf eine harte Oberfläche. Schneiden Sie die Öffnung frei mit einem Skalpell. </li><li> Unter Verwendung einer Pipette P1000, füllen 2 ml 3% hochschmelzender Agarose in S-Basal in die Schüssel. Legen Sie die Agarose auf den Bereich, der die Öffnung umgibt, und lassen Sie festigen. Warten Sie, bis die Agarose fest. </li><li> Drehen Sie sich um die Schüssel und ziehen Sie die Schutzfolie, die die doppelseitige Klebeband umfasst, so dass die Klebeseite wird auf dem Teller bleiben und ausgesetzt werden. Hinweis: Dadurch wird ein feiner Ring aus Klebeband der Außenseite der Öffnung zu umgeben. Die Agarose dient als Feuchtigkeitsspeicher, der später zu umgeben die Probe. </li></ol></li><li> Casting von Mikrokammern: <ol><li> Expose the PDMS Oberfläche zum Formen mit Luft-Plasma für 20-60 sec. Hinweis: Diese Plasmabehandlung macht die PDMS Oberfläche hydrophil, was das Einfangen von Luftblasen verhindert und schärfere Ausdrucke. </li><li> Konstruieren Sie zwei Abstandshalter von gleicher Höhe durch Stapeln 5-9 Objektträger aus Glas. Findet, die parallel zu ihren Längsseiten, die erste Abstandsstapel hat, kann eine Glasplatte, dann wieder einen Spacer Stack. Setzen Sie den Glasobjektträger, die die PDMS-Stempel orthogonal über den Abstandshaltern enthält. Einstellen der Höhe der Abstandshalter, so dass es einen Abstand von ungefähr 1,5 mm zwischen der Formoberfläche der PDMS-Stempel und dem einzigen Glasträger. </li><li> Geben Sie einen Tropfen heißen Flüssigkeit mit hohem Schmelzpunkt Agarose auf die einzelnen Objektträger in der Nähe der PDMS-Stempel und schnell schieben Sie die PDMS-Stempel vertikal in die Flüssigkeit Agarose. Lassen Sie die Agarose fest werden. Überprüfen Sie, ob es ein opakes Aussehen, die in der Regel dauert ca. 2 min bekommt. Ziehen Sie den Stempel vertikal mit einem Zug. Hinweis: Es ist bequem, glue der Abstandshalter gleitet zusammen mit doppelseitigen Klebeband. Die Vertikalbewegung des Stempels verhindert Luftblasen am Anfang in der Agarose gefangen. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Eier oder Würmer zusammen mit OP50 Bakterien auf der Agarose mit einem feinen Platindraht Pick. Verteilen Sie ein Ei oder ein Wurm pro Kammer zusammen mit Lebensmitteln mit der Wimper. Füllen Sie etwa 30 Eier auf einem Agarose-Pad. </li><li> Schneiden Sie die Agarose-Platte, die die gefüllten Mikrokammern in ein Quadrat von etwa 15 x 15 mm, so dass es schön in die Öffnung der Schale passt. Nehmen Sie den Platz Agarose-Platte mit einer Pinzette und legen Sie sie auf den Kopf auf einem Deckglas von 20 x 20 mm. Einmal fiel, nicht heben Sie sie wieder oder schieben Sie es um, da dies kann dazu führen, die Bakterien und Würmer aus ihren Kammern geschoben werden. </li><li> Montage der Schale: <ol><li> Legen Sie das Deckglas auf die Öffnung des Kunststoffschale. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas auf den Ring von doppelseitigen Klebeband hergestellt.Achten Sie darauf, das Glas zu brechen. </li><li> Drehen Sie die Schüssel auf den Kopf und verwenden Sie eine P1000 Pipette, die Lücke zwischen dem Agar Platte mit den Mikrokammern und der Agarose Reservoir mit Flüssigkeit mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose auf etwa 30 ° C gekühlt zu füllen. Warten Sie, bis die Agarose erstarrt ist. </li><li> Verschließen Sie die Schüssel mit Deckel. Für inverse Mikroskope mit einem beheizten Deckel. Für aufrechte Mikroskope mit einem normalen Deckel und verschließen Sie die Schale mit Parafilm. </li></ol></li><li> Nach Beendigung der Herstellung von Mikrokammern, überprüfen Sie sie unter einem Stereomikroskop. Die richtige Füllung ist von entscheidender Bedeutung. Siehe die Diskussion für Details. </li></ol> 4. Calcium Imaging <ol><li> Verwenden transgenen Stämmen, genetisch kodierte Calciumsensoren wie HBR16 (goeIs5 [PNMR-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3&#39;UTR, unc-119 (+)]) 27. </li><li> Verwenden Sie einen zusammengesetzten Mikroskop für Weitfeld-Epifluoreszenz ausgestattet. Schließen Sie die TTL Ausgang des EMCCD KameraDie TTL-Eingang des LED, so dass jedes Mal, wenn die Kamera ein Rahmen die Probe beleuchtet wird. Verwenden Sie eine Belichtungszeit von etwa 5 ms. Verwenden Sie EM Gewinn im Bereich von 50 bis 300. </li><li> Geben Sie eine Burst-Film läuft 24 Stunden lang mit jeder Wurm ist alle 15 abgebildet - 30 min ersten 20 Sekunden mit DIC, dann für 20 Sekunden mit einem GFP-Fluoreszenz zu erfassen GCaMP, und dann eine endgültige Bild des mKate2 Signal wird aufgenommen Steuerung für Expressionsniveaus. Verwenden Sie eine Bildrate von 2 / sec bei jedem Burst. </li><li> Für die visuelle Datenprüfung, verwenden Sie ein Falschfarbenkarte, die Sichtbarkeit von kleinen Änderungen der Fluoreszenzintensität zu erhöhen. Plot Fluoreszenzdaten &amp; Delta; F / F, wobei F die durchschnittliche Ausgangswert der Fluoreszenz. Eine detaillierte Beschreibung der Calciumdatenanalyse sind in der Literatur 20 gefunden werden. </li></ol> 5. Parallel AMI von Multiple Worms <ol><li> Die Schale mit den Mikrokammern auf das Mikroskop, den Schwerpunkt auf die Probe und die Fest autofocus. Einrichten eines Software-Protokoll, so dass die Kamera nimmt einen Ausbruch von 40 Bildrahmen in 20 sec jede halbe Stunde für 24 Stunden, die in 1.920 Bildern pro Wurm, eine angemessene Menge von Daten führt. Einrichten der Scan, so dass es besucht jeden Wurm mit der Bühne. Ziel ist es, etwa 30 Würmer Film in einem Durchlauf. </li><li> Bild mehrere Würmer durch Verkleinern, dh mit einer niedrigeren Vergrößerung. Verwenden Sie eine niedrigere Vergrößerung auf mehrere Mikrokammern mit dem Kamerachip zu decken und zu filmen mehrere benachbarte Mikrokammern gleichzeitig. Nach dem Ende der Bildaufnahme, trennen die Daten für jede einzelne Kammer, die durch Zuschneiden eines Bereichs von Interesse abdeckt einem Tier. </li><li> Um die Mobilität Daten schnell zu beurteilen, verwenden Rahmen Subtraktion 28-32. </li></ol> 6. Imaging verschiedenen Lebensphasen von C. elegans <ol><li> Verwenden Agarose Mikrokammern für alle Lebensphasen von C. elegans von L1 zu Erwachsenen und einschließlich dauers. Verwenden Sie die entsprechenden Kammer Abmessungen für difschiedlichen Lebensphasen, die in Tabelle 1 gezeigt werden. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Lebensstadium </td><td> Kammergröße </td><td> Kammertiefe </td><td> Normaler Aufnahme </td><td> Vergrößerung </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 um </td><td> 10-15 &amp; mgr; m </td><td> Ei - Mitte L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 &amp; mgr; m </td><td> 15 &amp; mgr; </td><td> Ei - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> Dauer-Larve </td><td> 370 x 370 &amp; mgr; m </td><td> 25 um </td><td> 4 Tage </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td><td> junge L4 - junge Erwachsene </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Junge Erwachsene </td><td> 700 x 700 um </td><td> 45 um </td&gt; <td> 12-24 h </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Chamber Größen für unterschiedliche Lebensphasen. Es zeigen Kammerabmessungen und Vergrößerungen, die für verschiedene Stufen für einen 8 x 8 mm-Kamerachip optimiert sind.

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P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hardware Der Fokus des Mikroskops wird typischerweise während einer Langzeitbildaufnahme driften. Für Durchlichtmikroskope, konzentrieren Buchführung Systeme können von den großen Mikroskophersteller erworben werden. Im Falle einer Verbindung, Mikroskop mit Fokussteuerung ist zu teuer, wäre eine einfache Alternative zu einem Stereomikroskop zu verwenden. Durchlichtmikroskope ermöglichen die Verwendung von Objektiven mit hoher numerischer Apertur (NA) und kann leicht automatisiert werden. 40X Öl Ziele sind gut geeignet. Wasserimmersionslinsen sind nicht ideal, da der Verdampfung während der Langzeit-Bildgebung. Differentialinterferenzkontrast (DIC) erzeugt einen schönen Kontrast, die morphologische und Verhaltensänderungen zu folgen hilft, aber einfache Hellfeldabbildung kann auch verwendet werden. Für DIC oder Hellfeldabbildung, benutzen rotes Licht, indem Sie einen Rotlichtfilter in die dia-Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops. Für das Scannen von mehreren Mikrokammern ist ein automatisiertes Stufe erforderlich. Die beste Leistung ist achieved, wenn eine Stufe verwendet wird, das nicht-lineare Beschleunigung und Verzögerung hat und kann zu geringen Scan-Geschwindigkeit eingestellt, die Tiere während des Scannens zu stören, um zu verhindern. Wir haben beobachtet, Verhaltensreaktionen oder Calcium Erhöhung mechanosensitive Neuronen (ALM und PLM) während der Abtastung, was darauf hindeutet, dass eine langsame Abtastung in der Tat nicht die mechanosensitive System der Schnecke aktiviert (Daten nicht gezeigt). Kommerzielle LED-Systemen verwendet werden. Mehrere Firmen bieten ready-to-use-Lösungen, die die LEDs mit unterschiedlichen Wellenlängen enthalten. Die LED sollte die Möglichkeit haben, von außen die Auslösung der LED mit einem TTL-Signal. Eine hochempfindliche Kamera ist für Calcium Imaging von bewegten Tieren notwendig. EMCCD- Kameras sind die empfindlichsten Kameras auf dem Markt. Die Kamera braucht, um eine TTL-Ausgang während der Exposition (auch als &quot;Feuer&quot; output) haben. Ein Deckelheizung erforderlich ist, um eine Kondensation auf dem Deckel zu verhindern, wenn unter Verwendung eines Umkehrmikroskops. Auf einem aufrechten Mikroskop, wird die Schale gelegt werden, so dass der Deckel will am Boden und somit Kondensation verhindert und kein Deckel Heizung benötigt wird. Der Deckel muss fest schließen Sie das Gericht um die Verdampfung von Wasser während der langfristige Bildgebung zu verhindern. PDMS-Stempel Die Oberfläche des PDMS-Stempels, der die Struktur zum Formen der Agarose enthält, wird von der Glasplatte, die die PDMS-Stempel unterstützt konfrontiert. Eine Liste mit Unternehmen, die kundenspezifische Mikrofluidik-Chips bieten auf Wikipedia gefunden werden ( <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> ). Füllen der Nematoden in ihre Kammern Dies ist der wichtigste Schritt im Protokoll und die folgenden Punkte zu beachten: a) Die Feuchtigkeit der Agarose ist von entscheidender Bedeutung für die Übertragung der Würmer und für die Bildgebung. Wenn die Agarose zu feucht ist, dh es ist eine Flüssigkeit covERING eine Fläche von mehreren Mikrokammern, wird es nicht möglich sein, bakterielle Lebens und Würmer in einer gesteuerten Weise zu verteilen, weil die Flüssigkeit macht die Bakterien wegfließen. Wenn die Agarose zu trocken ist, dann die Bakterien und Würmer nicht bekommen können aus dem Pick einfach was bedeutet, dass erhöhter Kraft muss verwendet werden, um die Würmer und Bakterien, die leicht verursacht Schäden an der Agarose fallen werden. Beim Füllen in eine Menge von Würmern die Agarose kann austrocknen. Im schlimmsten Fall wird die Agarose so trocken in dem Ende, das die Kammern zusammenbrechen können. Wenn die Agarose zu trocken ist, kann es durch Anordnen eines kleinen Tropfen (etwa 2 &amp; mgr; l) des S-Basal auf die Seite des Chips, wo es keine Würmer rehydratisiert werden. Dann tauchen Sie den Platindraht holen in die Flüssigkeit zu ziehen und sogar ein Teil der Flüssigkeit in den Bereich, in dem die Kammern mit Würmern gefüllt. B) Die Menge der Nahrung ist entscheidend für die erfolgreiche langfristige Bildgebung. Wenn es nicht genügend Nahrung, können die Würmer aus der sie auszuführen. Bei übermäßigem Essen der Hohlraum der Kammernicht wie eine Flüssigkeit, sondern wie eine feste verhalten und ermöglicht Würmer aus der Kammer, indem die Bakterien zu entkommen. Ziel ist es, eine Bakteriensuspension, die die gesamte Kammer ausfüllt erhalten. Die Würmer sind während des Experiments konstant physischen Kontakt mit dem Agar und Glasoberfläche über den größten Teil ihrer Länge und der kriechenden Verhalten scheint ähnlich wie die Bewegung auf einen Teller und unähnlich in flüssiger Prügel zu sein. C) Mechanische Beschädigung der Agarose kann das Experiment ruinieren. Eine feine Wahl ist wichtig. Es sollte keine scharfen Kanten. Ein weiches Augenwimper an einem Pipettenspitze befestigt werden verwendet, um Bakterien oder Würmer in die Kammern anstelle der Verwendung eines Platin-Pick bewegen. In den meisten Fällen ist jedoch übertrocknete Agarose der Grund für Beschädigungen. Die Pick oder Wimpern sollte im Idealfall nur kaum berühren Sie die Agarose selbst und den Wasserfilm auf der Agarose-Oberfläche sollte Würmer und Bakterien abziehen. Beim Abdichten der Kammern, ist wieder die Feuchtigkeit der Agarose wesentlich. Es sollte nichtwerden jegliche freie Flüssigkeit auf der Agarose-Oberfläche, da dies Bakterien und Würmer während der Versiegelung abzuwaschen. Große Blasen können durch leichtes Anheben an einer Ecke des Agar-Platte entfernt werden. Kleine Blasen, die kleiner als die Kammer erhalten häufig innerhalb der Kammern eingeschlossen sind. Diese Blasen sind kein Problem und wird durch Absorption verschwinden. Nach der Montage der Schale, klicken Sie hier, dass die Agarose ist nicht zu trocken oder zu nass. Die Kammern sollten gut verschlossen sein und es sollte keine Strömung der Flüssigkeit zwischen den Kammern sein. Wenn die Agarose zu nass ist, werden die Kammern nicht richtig abdichten. Worms kann fliehen oder ihre Nahrung weg gewaschen werden. Wenn die Probe zu feucht, einfach öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Agarose trocken für eine Minute oder zwei. Wenn die Agarose zu trocken ist, können die Kammern zusammenbrechen und die Würmer zu entkommen. Aufstockung durch Verkleinern Für Fluoreszenz-Bildgebung, Verkleinern wird durch die geringe Lichtmenge bei niedrigeren Vergrößerungen erhalten begrenzt. Auch EMCCD Kameras sind für die Empfindlichkeit optimiert und haben oft eine relativ geringe Auflösung. , Die Aufstockung der bildgebenden Vierfache ist jedoch ebenfalls möglich. Beispielsweise können vier Kammern von 190 um x 190 um auf einem Frame bei der Verwendung von 140X Vergrößerung (unter Verwendung eines 20x-Objektiv und eine 0,7X Kamerahalterung erreicht) und einem 512 x 512 Pixel, 8 x 8 mm Kamera passen. Eine hochauflösende Kamera mit einem großen Chip (wie sCMOS Kameras, 16,6 mm x 14 mm-Chip, 2560 x 2560 Punkte = 5,5 Megapixel) optimiert die Aufstockung von DIC und Hellfeldabbildung. Zum Beispiel bis zu 30 L1 Würmer in 190 um x 190 um Kammern auf jeder Rahmen dieser Kamera zu passen, wenn unter Verwendung eines 100-facher Vergrößerung (siehe Abbildung 3). Im Prinzip herauszoomen und Scannen kann auch kombiniert werden, um noch größere Zahl von Tieren zu erhalten. Die meisten Neuronen bleiben ganz gut im Fokus, so dass nur eine Brennebene muss abgebildet werden. Wenn Nervenzellen gefunden werden, um aus dem Fokus zu bewegen, AZ-Scan mit einem Piezoantrieb kann zu jedem Zeitpunkt p genommen werdenoint. Anpassung an unterschiedliche Verhaltensweisen Dieses Protokoll gibt eine gute Vorstellung über das Verhalten auf langen Zeitskalen. Offensichtlich ist das Timing der Bursts muss auf unterschiedliche Verhaltensweisen und Lebensabschnitte angepasst werden. EINSCHRÄNKUNGEN DER TECHNIK Verschiedene Faktoren beschränken die Dauer der Bildgebung. Die wichtigste ist die Menge der Nahrung. Sobald die Nahrung konsumiert wird, zu stoppen Larven entwickeln. So wird in kleinen Kammern (190 x 190 um) Würmer zu entwickeln, bis die Phase L3 und dann verhaften. Wenn längere Belichtungszeit erforderlich ist, grßere Kammern verwendet werden. Die maximale Laufzeit der langfristigen Bildgebung ist in dem Bereich von 2,5 - 3 Werktagen. Wenn mehr Bildgebung erforderlich ist, müssen die Würmer zurückgewonnen und in neue Kammern platziert werden. Bei der Abbildung erwachsenen Würmer, wird eine weitere Begrenzung durch die Nachkommen dieser Würmer verursacht. Erwachsenen Würmer legen Eier, aus denen Larven schlüpfen. Diese Larven werden auch in der Kammer bleibenVerbrauchen Nahrung, und kann die Bildanalyse zu stören. Wenn Nachwuchs ein Problem ist, ist eine Lösung, um entweder sterile Erwachsene oder wiederholt setzen die Würmer an die frische Kammern. Würmer zu erholen, wird die Agarose-Platte in die Kammer, das freie mit einem Skalpell geschnitten wird, wird das Deckglas gezogen wird, und wird auf einer NGM Platte, aus der die Schnecken gewonnen werden können platziert. Eine weitere Beschränkung ist die Beschränkung der Schnecken auf relativ kleine Bereiche. Dies kann ein Problem sein, wenn Langstreckenbewegung muss analysiert werden. Während die Tiere in den Kammern mechanisch und optogenetically 21,27,34,35 stimuliert werden, wird die Art des abgedichteten Kammer machen es schwierig, lösliche oder flüchtige Stimulanzien anzuwenden. Biologisch wichtige Gase wie Sauerstoff oder Kohlendioxid, kann frei in den Agar diffundieren. Die große Luftbehälter in die Schale sollte die Gaskonzentrationen in den Kammern im Laufe der Zeit für Experimente benötigt konstant zu halten. Es ist jedoch zu beachten, dass der lokale Sauerstoff concentratio gehalten werdenn in der Kammer kann mehr ähneln die Bedingungen in flüssiger Kultur als Kultur auf der Platte gefunden. Bedeutung in Bezug auf bestehenden Verfahren Mikrofluidischen Bauteilen haben stark fortgeschritten Verhaltens- und Entwicklungs studierte in C. elegans. Oft werden mikrofluidischen Strukturen aus PDMS 12 hergestellt. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Erzeugung von mikrofluidischen Kulturkammern aus Agarose hergestellt. Die Stärke dieser Technik ist die Kombination von hoher Bildqualität, Korrelation Verhalten physiologische Messungen, Langzeit-Bildgebung und einer angemessen hohen Durchsatz. Hohe Bildqualität wird durch die Abbildung durch das Deckglas mit hoher NA Ziele erreicht. Als Ergebnis kann Fluoreszenzabbildung, wie Calcium-Bildgebung und die konfokale Abbildung subzellulären Strukturen durchgeführt werden. Da die Tiere nicht wie bei anderen Systemen immobilisiert, erlaubt es eine Korrelation Verhalten physiologische Messungen. Because die Tiere haben genügend Nahrung, sie weiter zu entwickeln ermöglicht langfristige Bildgebung. Dieses System kann Bild viele Würmer in einem Durchgang, weil die Tiere, ihre definierte Kammern beschränkt. Somit kann dieses Verfahren leicht bis 9,27,34-36 skaliert werden. Zukünftige Anwendungen Bisher hat dieses System wurde hauptsächlich verwendet, um das Schlafverhalten in C. studieren elegans L1-Larven. Allerdings wird die Anpassung an alle Stufen es ermöglichen, eine Vielzahl von Verhaltensweisen auch dauers und Erwachsene zu studieren. Eine breite Palette von Verhaltensweisen können mit dieser Technik von Paarung Eiablage untersucht werden.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>high-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP(E)164-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Vision Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compound microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>now sold as iXon Ultra 897</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-23G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lid heater</td>
			<td>MPI workshop</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Nano Scan Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x-y-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Proscan III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stamp</td>
			<td>Abbott Laboratories&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red light filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET660/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td colspan="2">Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided sticky tape</td>
			<td>Sellotape/Henkel</td>
			<td>double sided 12mm x 33 m</td>
			<td>alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

Verhalten wird durch das Nervensystem gesteuert. Calcium-Bildgebung ist ein einfaches Verfahren, bei dem transparenten Nematode Caenorhabditis elegans, die Aktivität von Neuronen bei verschiedenen Verhaltensweisen zu messen. Mit Verhalten korrelieren neuronale Aktivität, sollte das Tier nicht immobilisiert werden, sondern sollte in der Lage, sich zu bewegen. Viele Verhaltensänderungen während des langen Zeitskalen auftreten und erfordern über viele Stunden des Verhaltens der Aufnahme. Dies macht es auch notwendig, um die Würmer Kultur in Gegenwart von Nahrung. Wie kann Würmer gezüchtet werden und ihre neuronale Aktivität über lange Zeitskalen abgebildet? Agarose Mikrokammer Imaging (AMI) wurde zuvor die Kultur entwickelt und beobachten kleinen Larven und ist jetzt angepasst worden, um alle Lebensphasen von der frühen L1 bis zum Erwachsenenstadium C. studieren elegans. AMI kann auf verschiedenen Lebensphasen einer C durchgeführt werden elegans. Langfristige Kalzium-Imaging ohne Immobilisierung der Tiere durch kurze extern getriggert Belichtungen com erreichtmit einem Elektronenvervielfachungs charge-coupled device (EMCCD) Kameraaufnahme kombiniert. Verkleinern oder Scannen, um die Bild bis zu 40 Würmer in parallel skalieren diese Methode. Somit wird ein Verfahren zur Bildverhalten und die neuronale Aktivität über lange Zeiträume in allen Lebensstadien von C. beschrieben elegans.

Agarose Mikrokammern können zu jeder Lebensphase von C angewendet werden elegans. Wie in 1A zu sehen ist, können Larvenentwicklung und Schlafverhalten während L1 lethargus beachten. Dargestellt sind die Kammergrößen 190 x 190 um, 10 um tief sind. Wenn längeren Zeitskalen erforderlich sind, können größere Kammern verwendet werden. Wie in Figur 1B zu sehen ist, mit einer Kammer mit größeren Abmessungen (370 x 370 um, 25 um tief) erlaubt die Entwicklung von C. elegans vom Ei bis zum erwachsenen. 1C zeigt eine Analyse des Langzeitverhaltensänderungen in Frame Subtraktion einer Schnecke vom Ei bis zum erwachsenen in einer Kammer aufgewachsen. Dargestellt sind mittleren Intensitäten nach Subtraktion Rahmen für ausgewählte Bursts während Gefolge und lethargus. Desto geringer ist die Durchschnittsintensität nach Rahmen Subtraktionswerte ist, desto niedriger die Mobilität des Wurms. Gezeigt, werden von einem Gefolge Zustand und einem Zustand lethargus pro Larvenstadium ausgewählt Burst-Spuren. Diebeobachteten Anstieg der Durchschnittsintensität während der Entwicklung ist vor allem auf einen erhöhten Kontrast und Größe des Tieres. 1D zeigt eine dauer Larve, eine alternative Lebensphase, die bei widrigen Umgebungsbedingungen 33 tätig ist. Kammergröße ist 370 x 370 &amp; mgr; m, 15 &amp; mgr; m tief. Beachten Sie, dass die dauer Larve wurde ohne bakterielle Nahrung in die Kammer eingebracht, die Ausfahrt von der dauer Larvenstadium verursachen würde. 1E zeigt einen erwachsenen Wurm, der bereits viele Eier gelegt hat, in die Kammer. Kammer Abmessungen für den Erwachsenen verwendet wurden, waren 700 x 700 um, 45 um tief. Schließlich zeigt 1F einen erwachsenen Hermaphroditen und ein männliches Gegen Inneren eines Erwachsenen Kammer. Kalzium-Imaging in motile Würmer ist mit GCaMP Calcium-Sensoren möglich. 2A, B zeigen Kalzium-Imaging des Befehls Intern AVA für einen L1-Larve 27. 2C, D Calcium-Aktivität für die sa zeigenme Art von Neuron in einem erwachsenen Tier. Aufstockung der langfristige Bildgebung ist durch Abtasten und durch Zoomen out möglich. 3A zeigt die Bildqualität der gleichzeitigen Darstellung von 30 Würmer auf einem Kamera-Chip mit einer 5-Megapixel-Kamera. 3B zeigt die Bildqualität von 4 Würmer Calcium gleichzeitig abgebildet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> Abbildung 1. Die Anpassung der AMI auf alle Lebensphasen von C. elegans. (A) Larve von früh bis früh L1 L2 Phase in 190 x 190 um Kammern abgebildet. (B) Entwicklung vom Ei bis zum erwachsenen in einem 370 x 370 um Kammer. (C) Mobility eines Schnecken bewertet mit Rahmen Subtraktion. Dargestellt ist die mittlere Intensität aller Bilder von der Bildrahmen nach Subtraktion für eine ausgewählte Burst-Film für jeden Larven stage zur Folge und lethargus Verhalten. (D) A dauer Larve in der Abwesenheit von Nahrung in einem 370 x 370 um Kammer. (E) Erwachsene Zwitter mit vielen Eier in eine 700 x 700 um Kammer gelegt. (F) Mating eines Mannes und ein Zwitter in einem 700 x 700 um Kammer. YA bedeutet, jungen Erwachsenen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> Abbildung 2. Calcium-Bildgebung mit AMI. (A) Calcium-Bildgebung mit GCaMP3 in der Befehlsintern AVA von L1-Larven mit Hilfe der NMR-1-Promotor. Dargestellt sind zwei Falschfarbenbilder. Im linken Bild ist die Aktivität der AVA niedrig und der Wurm nicht einen Rückwärtsbewegung. Im rechten Bild die Aktivität der AVA ist<html> hoch ist, und die Schnecke rückwärts bewegt. (B) Calcium-Transienten über die Zeit für einen L1-Wurm. (C, D) Calcium Transienten bei einem erwachsenen Tier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3. Imaging mehrere Würmer parallel durch Verkleinern. (A) Einzigartige Bilder aus 30 L1 Würmer pro Bild mit 190 x 190 um Kammern und ein 100-facher Vergrößerung (unter Verwendung eines 10X-Objektiv) und eine 16,6 x 14 mm Kamerachip. (B) Gleichzeitiges Abbilden vier L3 Würmer pro Rahmen mit 370 x 370 um Kammern und 100-facher Vergrößerung und einem interessierenden Bereich eines 16,6 x 14 mm Kamera-Chip.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.4K Aufrufe.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

Serie: Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Positive Butanone Learning, kurzfristige und langfristige Assoziative Speicher Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

A Molecular Auslesen Langfristige Olfactory Anpassung in<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo Neuronale Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Methoden zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Psychopharmaka in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

Langfristige Verhaltens Verfolgung von Frei Schwimmen Schwach elektrische Fische

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

EIN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Nährwert-basierter Kupfer-Aversion-Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Erzeugung und Langzeitpflege von Nervenfreiheit<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...