<p class="jove_content"&gt; Wir danken Dr. Shuang Liu für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Die PCL12 Konstrukt war ein Geschenk Form Dr. Christopher D.-Link. Diese Arbeit wurde von zwei National Science Foundation Zuschüsse (0842708 und 1026958) und ein AHA Zuschuss (09GRNT2250529) auf FS unterstützt.</p

1. Bau von transgenen Worms <ol><li> Transformation. <ol><li> Bereiten Injektion Pads. Geben Sie einen Tropfen von heißem, 2% Agarose in Wasser gelöst, auf ein Deckglas. Schnell stellen ein zweites Deckglas auf dem Tropfen und klopfen es. Nachdem die Agarose erstarrt ist, Dia-Deckgläser auseinander, und backen das Deckglas-Pad in einem Vakuumofen bei 80 ° CO / N. </li><li> Ziehen Pipetten. Wir verwenden eine Sutter P-97 Abzieher 1/0.5 mm OD / ID Borosilikatglas Kapillaren mit Faden ziehen. Pipetten mit geschlossener Spitze, die offen zu einem späteren Zeitpunkt unterbrochen geschmiedet. </li><li> Bereiten Injektion mischen. Machen Sie das Gemisch, das die Einspritzung DNA von Interesse (20 ng / ul pro Konstrukt) zzgl. leer Plasmid-DNA zu einer endgültigen Konzentration von 150 ng / ul. Zentrifuge die Injektion Mischung, jede Verunreinigung zu entfernen. Dieser Schritt ist wichtig, weil Verunreinigungen reduzieren Transformationseffizienz. Übertragen Sie die Top-5-ul (Ablagerungen und andere Verunreinigungen sammeln sich im Boden) in ein frisches Röhrchen zu be in Injektion verwendet. </li><li> Legen Injektion Mischung durch Kapillarwirkung. Der Boden der Pipette in der Injektion Mischung getaucht. Typischerweise 0,5 ul ausreichen, um 100 Würmer injizieren. </li><li> Legen Injektionspipette. Legen Sie die Pipette auf den Halter des Mikromanipulators und brechen sie offen durch Reiben ihrer Spitze gegen die Kante eines Deckglas auf einem Objektträger aus Glas oder alternativ gegen Schmutz auf der Agarose-Pad angebracht. Dies ist ein entscheidender Schritt, da zu groß Tipps Schäden der Wurm zu klein und Tipps sind leicht verstopft. Die Qualität der abgebrochene Spitze kann durch die Form und vor allem durch die Strömungsgeschwindigkeit gemessen werden. Die Fließgeschwindigkeit kann durch die Größe der Blasen, die sich aus der offenen Spitze in einem Tropfen Halogenkohlenstoff 700 Öl in Reaktion auf einen Einspritzdruck eingetaucht beurteilt werden. </li><li> Übertragen Würmer Injektion Pad. Geben Sie einen Tropfen von 700 Halocarbonöl auf einer Spritzgießmaschine Pad und übertragen mehrere (1 oder 2 für Anfänger) Würmer auf das Öl. Verwenden Sie einen Wurm holen, um die Würmer nach unten drücken, auf das Kissen, bis diey auf der Agarose haften. Worms sollte in Reihen mit ventralen Seiten in die gleiche Richtung orientiert. Berühren Wurm den Kopf. Wenn nach mehreren Versuchen die Würmer auf dem Pad nicht einhalten, mit einem frischen Pad ersetzen oder erhöhen Agarose Dicke und / oder Konzentration. </li><li> Legen Sie die Pipette in die Wurm. Durch Bewegen der Bühne, positionieren Sie den Wurm unter der Pipette. Positionieren Sie die Pipette in den zentralen Kern der Gonade, weil seine Zytoplasma von vielen Keimzelle Kernen gemeinsam genutzt wird. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, die injiziert DNA viele Nachkommen zu liefern. Die Pipette sollte liegen fast parallel zu der Schnecke (~ 15 ° -25 ° Winkel). Drücken Sie vertikal die Spitze der Pipette nach unten des Wurms Körper, bis die Haut gedrückt wird. Dann vorsichtig am Manipulator tippen, um die Spitze Einsetzen induzieren. Für beste Ergebnisse spritzen beide Keimdrüsen. </li><li> Injizieren Sie die DNA-Lösung. Üben Sie Druck auf die Pipette, bis die Gonade schwillt an. Stoppen Sie den Fluss und ziehen Sie den Wurm aus der Pipette. Testen Sie die Nadel für Durchfluss und verschieben Sie dannzum nächsten Wurm, und wiederholen Sie die Schritte Injektion. </li><li> Recover die Würmer: Fügen Sie einen Tropfen (~ 10 ul) Erholung Puffer auf die Würmer und inkubieren, bis die Würmer schwimmen beginnen. In das gleiche Volumen M9, warten, bis wieder Würmer Schwimmen und mehrmals wiederholen, bis die Lösung ist meist M9. Individuell übertragen Würmer gesetzten Platten. </li></ol></li><li> Integration. <ol><li> Zeigen 40 gesund, wohlgenährt, L4 Würmer in eine frische Platte </li><li> Irradiate mit γ-ray mit 4.000 rad für 40 min. Übertragen bestrahlten Würmer (P0) in frischen, OP50 ausgesät Platten (4 Würmer / Platte). Worms kann alternativ mit einer Dosis von 300 J / m 2 UV-Vertices bestrahlt werden. </li><li> Übertragen 10-20 F1 Transformanten von jeder Platte zu einzelnen Platten bezeichnen die Platten mit dem entsprechenden P0 Ursprungs. </li><li> Einzel-out 2-4 F2 Transformanten für jeden F1 zu getrennten Platten. Überprüfen Sie die F3 Nachkommen für 100% Transmission der Transformation Marker. Typischerweise 1-3% der Nachkommen einer bestrahlten Wurm will eine Integration Veranstaltung. </li><li> Machen Bestände von drei oder mehr unabhängigen Transformantenlinien. </li></ol></li></ol> 2. Behavioral Assays <ol><li> Alter-Synchronisation. <ol><li> Wachsen Würmer in Standard 10 cm NGM-Platten + OP50 E. coli, bis eine große Population von schwangeren Erwachsenen erreicht ist (3-5 Tage). </li><li> Sammeln Sie die Würmer in 50 ml Falcon-Röhrchen durch die Aussetzung in 1 ml M9-Puffer. </li><li> 5 ml M9-Puffer und Zentrifuge bei 450 xg für 3 min. Überstand verwerfen. Wiederholen Sie 3-4x. </li><li> Am Ende der letzten Zentrifugation den Überstand entfernen und hinzufügen 10 Bände der grundlegenden Natriumhypochlorit-Lösung (0,5 M NaOH, 1% Natriumhypochlorit frisch gemischt) zu den pelletierten Würmer. Inkubation bei RT für ~ 10 min. Die Lyse Reaktion kann, indem ein Tropfen der Lysereaktion auf einem Deckglas und Prüfung der Würmer unter dem Mikroskop beobachtet werden. Bei rund 80% der Würmer gebrochen werden sollte die Reaktion gestoppt werden. </li><li> Stoppen Sie die Reaktion durch Lyse adding das gleiche Volumen an sterilem Puffer Ei. </li><li> Sammeln Sie die Eier (und Karkassen) durch Zentrifugation bei 450 xg für 5 min. </li><li> Waschen Sie die Eier mit sterilem Ei Puffer 2-3x. </li><li> Inkubieren Sie die Eier O / N in M9-Puffer und Samen sie auf Standard NGM-Platten. </li></ol></li><li> Chemotaxis-Assay. <ol><li> Bereiten Sie mehrere Stücke von Agar etwa 0.5x0.5x0.5 cm. Wir deponieren die Agar in einer 10-cm-Platte und wir schneiden die Agar Brocken von dort. </li><li> Einweichen Agar Chunk in einer Lösung, die das gewünschte Lockstoff (bei Sättigung nahe-sättigenden Konzentrationen) für 2 Stunden. Typische Lockstoffe Lysin (0,5 M), Biotin (0,2 M). </li><li> Deposit ein Agar-Stück in einer 10 cm Testplatte in dem der Ort einer Test-Ort und ein Kontrollfeld markiert wurden (Abb. 1A). Erlauben Äquilibrierung und Bildung eines Gradienten O / N (1B). Bereiten Sie 5 Platten für ein einzelnes Experiment. </li><li> Vor dem Experiment werden 10 ul 20 mM NaN 3 (anesthetic) an jedem Punkt. </li><li> Platz 20 Jahren synchronisiert Würmer in der Mitte der Platte. Die Platte wird in den Inkubator bei 20 ° C. </li><li> Nach 1 Stunde, zählen die Tiere auf den Test / Kontrolle Flecken und berechnen Sie die Chemotaxis-Index (CI) wie folgt: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width=".863in" fo:src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50435/50435eq1.jpg" /> wobei N, N-Test und N Cnt., geben Sie die Gesamtzahl der Tiere, die Zahl der Tiere in der Prüfung vor Ort und die Anzahl der Tiere in der Kontrollgruppe vor Ort. </li></ol></li></ol> 3. Primäre embryonale Zellkultur <ol><li> Lyse Würmer wie im Alter-Synchronisation beschrieben. </li><li> Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von Lyse das gleiche Volumen an sterilem Ei Puffer und Zentrifuge bei 450 xg für 5 min. Sanft Überstand verwerfen dabei darauf achten, nicht zu verlieren pelletiert Eier. Wiederholen Sie 2-3x oder bis Überstand klar ist. </li><li> Sedimentierte Eier (und Karkassen) In 2 ml sterile Ei-Puffer und 2 ml sterile 60% Saccharose in Ei-Puffer. Mischen Sie diese Lösung, bis Eier vollständig resuspendiert (wie sie zu Klumpen unter Zentrifugation neigen) von Hand oder durch Vortexen. </li><li> Zentrifuge bei 450 xg für 15 min. </li><li> Vorsichtig den Überstand (mit den Eiern) in ein steriles Röhrchen. Verwerfen Pellet enthält die Kadaver und andere Nebenprodukte der Lyse. </li><li> Rückstände von Saccharose durch Resuspendieren die Eier in Ei-Puffer und Zentrifugieren bei 450 xg für 5 min. Vorsichtig sammeln und den Überstand verwerfen. 3x wiederholen. </li><li> Unter einer laminaren Haube resuspendieren pelletiert Eier in sterile Ei-Puffer mit 1 U / ml Chitinase bei RT, um die Eierschalen zu verdauen. Nach 30 min beginnen, um die Reaktion (unter einem inversen Mikroskop Zellkultur) zu überwachen. Jede Charge von Chitinase hat eine etwas andere Tätigkeit. Typischerweise Verdauung in 1 h abgeschlossen. </li><li> Bei etwa 70-80% Eierschalen werden von Chitinase Add CM-15 (L-15 Zellkultur med. verdautium enthaltend 10% fötales Rinderserum, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin). Dissociate Zellen unter Verwendung einer Spritze mit einer 27-Gauge. Filtern Sie die Zellsuspension mit einer 5,0 um Filter zu intakten Embryonen zu entfernen, Klumpen von Zellen und Larven. </li><li> Pellet das dissoziierte Zellsuspension durch Zentrifugation bei 450 xg für 15 min. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in CM-15 Zellkulturmedium. </li><li> . Platte dissoziierten Zellen auf Glas-Deckgläschen zuvor mit Erdnuss-Lectin (0,1 mg / ml) in Wasser gelöst beschichtet Hinweis: Zellen müssen an dem Substrat, um zu differenzieren. </li><li> Die Zellen können bei RT (16-20 ° C) in Luft für mehr als 2 Wochen aufrechterhalten werden. </li></ol>

<ol>
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Q., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+of+a+potassium+channel+causes+progressive+sensory+function+loss+during+aging.">Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).</li><li>Yu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons:+a+new+family+of+chemosensory+receptors.">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li><li>Caserta, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q-VD-OPh,+a+broad+spectrum+caspase+inhibitor+with+potent+antiapoptotic+properties.">Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).</li><li>Christensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primary+culture+system+for+functional+analysis+of+C.+elegans+neurons+and+muscle+cells.">A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells.</a> Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Hier beschreiben wir einen kombinierten Ansatz, um zelluläre und molekulare Aspekte der amylopathies mit C. studieren elegans. Die Vorteile dieses Ansatzes sind:. 1) niedrige Kosten C.elegans im normalen Petrischale mit Bakterien geimpft gehalten, bei Raumtemperatur. 2) Leistungsstarke Genetik. Transgene Tiere können in wenigen Monaten erreicht werden und eine Vielzahl von Promotorsequenzen ist, um die Expression des gewünschten Gens in spezifischen Neuronen fahren. 3) Einfach, gut charakte...

Amyloid beta (Aß) ein Peptid mit 36-43 Aminosäuren, die nach sequentieller Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) durch β und γ-Sekretase 1 gebildet wird. Die γ-Sekretase verarbeitet die C-terminalen Ende der Aß-Peptid und ist verantwortlich für die variable Längen 5. Die häufigsten Formen von Aß Aß sind 40 und 42 Aß, wobei letzteres häufiger pathologische Zustände wie AD 5 zugeordnet. Bei hohen Konzentrationen Aß Form β-Faltblättern, dass aggregieren zu bilden Amyloid-Fibrillen 6. Fibrillen Ablagerungen sind der Hauptbestandteil der senilen Plaques umliegenden Neuronen. Beide Plaketten und diffusionsfähig, nicht-Plaque Aß-Oligomere, wird angenommen, dass die zugrunde liegenden pathogenen Formen von Aß darstellen. Laboruntersuchung der neuronalen amylopathies wird durch die Tatsache, dass diese Bedingungen Zeitlicher Verlauf kompliziert. Daher ist es important zu genetisch manipulierbaren Tiermodellen komplementären entwickeln Mäuse-mit kurzen Lebensdauer. Diese Modelle können verwendet werden, um bestimmte Aspekte der amylopathies-Regel zellulären und molekularen und aufgrund ihrer Einfachheit dazu beitragen, das Wesen des Problems zu erfassen aufzuklären. Der Wurm Caenorhabditis elegans ist diese Kategorie fällt. Es hat eine kurze Lebensdauer, ~ 20 Tage und darüber hinaus grundlegende zelluläre Prozesse einschließlich der Regulierung der Genexpression, Protein-Trafficking, neuronale Konnektivität, Synaptogenese, Zellkommunikation und Tod sind ähnlich wie Säugetierzellen 7. Einzigartige Merkmale des Wurms enthalten leistungsfähige Genetik und der Mangel an einem Schiff, das zu neuronalen Schäden unabhängig von Gefäßschäden studieren können. Andererseits begrenzt der Mangel eines Gehirns die Verwendung von C. elegans zu studieren viele Aspekte der Neurodegeneration. Darüber hinaus kann die Wiedergabe und Identifizierung der anatomischen Verteilung der Läsionen in diesem Organismus durchgeführt werden. Andere Limittionen wie die Schwierigkeit, sowohl Unterschiede in der Genexpression Profile und Wertminderungen von komplexen Verhalten und Memory-Funktion zu beurteilen. Hier beschreiben wir Methoden, um C zu erzeugen elegans Modelle amylopathies.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>1. NGM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J637</td>
			<td>17 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-peptone</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J636</td>
			<td>2.5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 975 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3045</td>
			<td>1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>25 ml of 1M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2. Potassium phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>108.3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>35.6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>3. M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td>1 ml of 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>118 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td>48 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4880</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bring to 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sterilized by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5. CM-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-15 culture medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11415</td>
			<td>450 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>50 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>50 g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>6. Other Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon 700 oil</td>
			<td>Halocarbon Products</td>
			<td>9002-83-9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &mu;m Acrodisc Syringe Filter</td>
			<td>PALL Co.</td>
			<td>4199</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6137-5UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin (peanut)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>425044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans model system for amylopathy study

Amylopathy ist ein Begriff, der anomalen Synthese und Akkumulation von Amyloid-beta (Aß) im Gewebe mit der Zeit beschreibt. Aß ist ein Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) und wird in Lewy-Körper-Demenz, Einschlusskörperchenmyositis und zerebrale Amyloid-Angiopathie 1-4 gefunden. Amylopathies schrittweise mit der Zeit entwickeln. Aus diesem Grund einfache Organismen mit kurzen Lebensdauer kann helfen, molekulare Aspekte dieser Bedingungen aufzuklären. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle zu Aß-vermittelte Neurodegeneration mit den Wurm Caenorhabditis elegans zu untersuchen. So konstruieren wir transgene Würmer durch Einspritzen kodierende DNA menschlichen Aß 42 in die Syncytial Keimdrüsen von erwachsenen Hermaphroditen. Transformantenlinien werden durch eine Mutagenese-induzierte Integration stabilisiert. Nematoden sind Alter durch das Sammeln und Säen ihre Eier synchronisiert. Die Funktion der Neuronen, Aß 42 ist in opportun Verhaltensstörungen Assays getestet (Chemotaxis Assays). Primäre neuronale Kulturen aus Embryonen gewonnen werden, um Verhaltensänderungen Daten zu ergänzen und die neuroprotektive Wirkung von anti-apoptotischen Verbindungen testen.

Mit unserem Protokolle untersuchen wir die Auswirkungen der menschlichen Aß 42 Oligomer auf die neuronale Funktion 8. Ein Fragment, das menschliche Aß 42 und der künstlichen Signalpeptid kodierende Sequenz von Feuer Vektor pPD50.52 Konstrukt wurde aus PCL12 9 unter Verwendung der Primer, die eine Sma 1 Restriktionsendonukleasestelle an den Enden eingeführt. Das Fragment wurde dann in einem Konstrukt, das ein 2.481 bp FLP-6-Promotor-Sequenz in den Vektor pPD95.75 F...

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A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu studieren<em&gt; C. elegans</em&gt;. Wir zeigen, wie Würmer, die humane Aß konstruieren<sub&gt; 42</sub&gt; In Neuronen und wie sie ihre Funktion in Verhaltens-Assays zu testen. Wir zeigen, wie man weiter primären neuronalen Kulturen, die für pharmakologische Tests verwendet werden können, zu erhalten.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

10.4K Aufrufe.  University of Medicine and Dentistry of New Jersey. Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu studieren C. elegans. Wir zeigen, wie Würmer, die humane Aß konstruieren 42 In Neuronen und wie sie ihre Funktion in Verhaltens-Assays zu testen. Wir zeigen, wie man weiter primären neuronalen Kulturen, die für pharmakologische Tests verwendet werden können, zu erhalten.

Serie: A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant mechanism(s) of toxicity are still unclear. A&beta; is also deposited intramuscularly in Inclusion Body Myositis, a severe human myopathy. The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express human A&beta;. Depending on the tissue or timing of A&beta; expression, transgenic worms can have readily measurable phenotypes that serve as a read-out of A&beta; toxicity. For example, transgenic worms with pan-neuronal A&beta; expression have defects is associative learning (Dosanjh et al. 2009), while transgenic worms with constitutive muscle-specific expression show a progressive, age-dependent paralysis phenotype (Link, 1995; Cohen et al. 2006). One particularly useful C. elegans model employs a temperature-sensitive mutation in the mRNA surveillance system to engineer temperature-inducible muscle expression of an A&beta; transgene, resulting in a reproducible paralysis phenotype upon temperature upshift (Link et al. 2003). Treatments that counter A&beta; toxicity in this model [e.g., expression of a protective transgene (Hassan et al. 2009) or exposure to Ginkgo biloba extracts (Wu et al. 2006)] reproducibly alter the rate of paralysis induced by temperature upshift of these transgenic worms. Here we describe our protocol for measuring the rate of paralysis in this transgenic C. elegans model, with particular attention to experimental variables that can influence this measurement.

Assaying &amp;#946;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

The intensely studied nematode worm Caenorhabditis elegans can be transgenically engineered to express the human &beta;-amyloid peptide (A&beta;). Induced expression of A&beta; in C. elegans muscle leads to a rapid, reproducible paralysis phenotype that can be used to monitor treatments that modulate A&beta; toxicity.

Assaying β-Amyloid-Toxizität mit Hilfe eines transgenen C. elegans Modell

Accumulation of the &beta;-amyloid peptide (A&beta;) is generally believed to be central to the induction of Alzheimer's disease, but the relevant ...

Forschung

Neurowissenschaften

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Methoden zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Psychopharmaka in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Ein Test zur Messung der Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit der<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

EIN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Nährwert-basierter Kupfer-Aversion-Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometrischen Kalzium Imaging einzelner Neuronen im Verhalten Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic spines have been described for DD GABAergic neurons as the input sites from presynaptic cholinergic neurons in the motor circuit of Caenorhabditis elegans. This synaptic circuit can now serve as a powerful new in vivo model of spine morphogenesis and function that exploits the facile genetics and ready accessibility of C. elegans to live-cell imaging. 
This protocol describes experimental strategies for assessing DD spine structure and function. In this approach, a super-resolution imaging strategy is used to visualize the intricate shapes of actin-rich dendritic spines. To evaluate the DD spine function, the light-activated opsin, Chrimson, stimulates the presynaptic cholinergic neurons, and the calcium indicator, GCaMP, reports the evoked calcium transients in postsynaptic DD spines. Together, these methods comprise powerful approaches for identifying genetic determinants of dendritic spines in C. elegans that could also direct spine morphogenesis and function in the brain.

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are important cellular features of the nervous system. Here live imaging methods are described for assessing the structure and function of dendritic spines in C. elegans.&#160;These approaches support the development of mutant screens for genes that define dendritic spine shape or function.

Bildgebung dendritischer Dornen bei Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...