Name: culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Die Autoren möchten die Mitarbeiter der Biospherix für ihre Hilfe anzuerkennen, beim Erlernen der Xvivo geschlossenen Zellkultursystem zu verwenden, insbesondere Matt Freeman; das Personal von Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. für ihre Arbeit in der Labor-Infrastruktur, insbesondere Russ Hughes Einrichtung; die Mitarbeiter der Kinderkrankenhaus von Orange County Abteilung von Einrichtungen und Support Services für ihre Arbeit im Labor umbauen zu koordinieren, vor allem Adam Lukhard und Devin Hugie; die Mitarbeiter der Kinderkrankenhaus von Orange County Abteilung für Informationssysteme für ihre Hilfe bei der Datenmanagement-Infrastruktur und Remote-Zugriff, insbesondere Viet Tran Einrichtung; Kinderkrankenhaus von Orange County Executive Management Team für ihre langjährige Unterstützung des Projekts, vor allem Dr. Maria Minon und Brent Dethlefs. Diese Arbeit wurde von Kinderkrankenhaus von Orange County und dem California Institute for Regenerative Medicin finanzierte durch Gewährung TR3-05476 zu PHS. Alle Autoren trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.

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	<li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children's+Hospital+of+Orange+County:+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery.">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li><li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction.">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma.">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li><li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes.">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li><li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance.">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li><li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases.">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases.">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li><li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling.">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Zellen innerhalb der CPF gewachsen sehen keine Veränderungen in Sauerstoff oder Kohlendioxid-Konzentrationen, wie sie von Inkubator bewegen Kammer zu Behandlungskammer zu Mikroskop und zurück. Es ist wichtig, dass die Bedingungen in jeder Kammer an den jeweiligen Inkubator abgestimmt sind, in dem die Zellen gehalten werden, bevor die Zellen aus dem Inkubator entfernt werden. Die Atmosphäre innerhalb der Vorrichtung kontinuierlich HEPA-gefilterten und ist anpassbar in bezug auf Sauerstoff und Kohlendioxid-Konzentrationen. Zellen können in Standardkonzentrationen für PSCs oder NSC, 5% und 9%, jeweils aufgewachsen werden; oder alternative Konzentrationen können für verschiedene Zelltypen oder für bestimmte Experimente ausgewählt werden. Somit ist die Vorrichtung mit konstantem Quellen medizinischer Qualität Sauerstoff, Kohlendioxid und Stickstoff (Figur 4) zugeführt wird . Alle drei dieser Gase werden durch gasspezifische Verteilersysteme geliefert, die die konstante Versorgung gewährleisten. Die Vorrichtung ist außerdem mit einem Kalibriergas zugeführt Mischung, bestehend aus10% (± 0,01%) Kohlendioxid in Sauerstoff. Die Verteilersysteme sind außerhalb der Zelle Produktionsanlage untergebracht ist und die Gase in die Anlage durch die Decke geleitet. Das Kalibrierungsgas wird innerhalb der Anlage untergebracht. Das Gerät ist zusätzlich mit Hausvakuum, auch durch die Decke geliefert. Mit einem elektronischen Überwachungssystem und drahtlose Sendeeinheiten werden die Ausgangsdrücke aller Sammelleitungen ständig überwacht. Im Falle, dass jeder Druck außerhalb des Bereichs fällt, werden die Zellproduktionsanlagenbetreiber automatisch angerufen und mitgeteilt, so dass entsprechende Maßnahmen ergriffen werden können. Der Energiebedarf der Vorrichtung werden durch sechs dedizierte 120 V-Stromkreise erfüllt die von der Decke herabfahren und des Krankenhauses Back-up-Generatoren verbunden, um eine konstante Versorgung zu gewährleisten. Der Betrieb der Vorrichtung wird über die Software auf einem PC-basierten Computer über eine unterbrechungsfreie Stromversorgung mit Strom versorgt gesteuert. Diese Macht und Computeranordnungensicherzustellen, dass die Systemfunktionen kontinuierlich auch im Falle eines öffentlichen Netzsystemausfall. Die Software die Steuervorrichtung hat eine benutzerfreundliche graphische Schnittstelle (Abbildung 1) , die ebenso wie Temperatur, Feuchtigkeit, und die Kammer ermöglicht Drücke für die Kontrolle von Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen. Die Werte aller dieser Parameter werden kontinuierlich eine laufende Aufzeichnung aller Geräteparameter zur Verfügung zu stellen aufgezeichnet. Diese Daten werden jede Nacht auf einem Remote-Server gesichert, um ihre Integrität zu schützen. Der Computer und die Software kann von Administratoren Remote-Zugriff zu bewerten und / oder jeden Parameter ändern. Darüber hinaus kann der Computer und Software aus der Ferne zugegriffen werden kann, interaktive Beurteilung von Geräteparametern ermöglicht und mit lokalen Benutzern zur Fehlerbehebung. Eine zusätzliche Alarm-Sendeeinheit ist mit dem Gerät verbunden, so dass die Zellproduktion Anlagenbetreiber jeglicher Out-of-Range-Zustand des Gerätes informiert werden. Der RAS-capabilities lassen sich einloggen und Beurteilung der Besonderheiten des Out-of-Range-Zustand. Die Vorrichtung ist als modulares System entwickelt, um sowohl in einer Makro- und einer Mikro Sinn. Einzelnen Zellkulturmodule wie Inkubatoren und Behandlungskammern können in Bezug auf ihre Abmessungen und Anforderungen sowie in deren Anordnung in Bezug zueinander angepasst werden. Darüber hinaus sind die meisten der Steuerfunktionen der einzelnen Module selbst modular, so daß einzelne atmosphärische Gasregler, beispielsweise kann leicht ohne wesentliche Störung des Systems ausgetauscht werden. Spezialisierten Verarbeitungskammern, beispielsweise eine für die mikroskopische Visualisierung und Manipulation von Zellkulturen, an das System leicht angepasst werden. Sowohl Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskop sind innerhalb des Systems (Figur 6) , so daß Zellen können lebende gefärbt werden, und Kolonien können in den gleichen atmosphärischen Bedingungen wie im Inneren t zerlegt werdener Inkubatoren. Verlegen von Kabeln durch abgedichtete Durchführungen in den Seitenwänden der Behandlungskammer ermöglicht Geräten wie Stromversorgungen und Computer außerhalb der Vorrichtung gehalten werden, in der Regel auf einem Wagen (6). Die Behandlungskammern in der Zellproduktionsanlage haben einen anderen Luftstrom Muster als herkömmliche BSCs. Bei herkömmlichen BSCs fließt Luftstrom von einem zentralen Abluftöffnung nach unten und spaltet sich in zwei getrennte Ströme, die dann durch zwei verschiedene Belüftungsöffnungen im vorderen und hinteren Teil des Kabinetts des Boden aufgenommen. Im Gegensatz dazu hat das CPF eine einzige Entlüftungsöffnung in dem vorderen Teil der Decke. Luft strömt nach unten und in Richtung der Rückseite der Kammer, wo sie dann nach oben in eine Lufteinlassöffnung gesaugt wird. Obwohl die CPF von Natur aus sehr sauber ist, ist dieser einzigartige Luftstrom Muster bedeutet, dass Techniker müssen leicht ihre Technik anpassen das Risiko einer Kontamination zu reduzieren. Wie bei einem herkömmlichen BSC, ein Laborant should vermeiden, dass ihre Hände vor offenen Zellkulturplatten und Medien Flaschen platzieren. Jedoch, die die Richtung stromaufwärts wurde in dem CPF verändert Die Zellproduktionsstätte Labor selbst ist ziemlich Standard und ist mit einem -20 ° C Gefrierschrank ausgestattet, einem -80 ° C Gefrierschrank, 4 ° C Kühlschrank, eine Zentrifuge und ein Wasserbad. Das Labor hat auch ein Waschbecken mit Fußschalter für die bequeme Freisprechbetrieb. Um diesem Labor eine funktionelle klinischen Zellproduktionsstätte zu werden, müssen jedoch einige zusätzliche Modifikationen noch vorgenommen werden. Erstens muss die Vorrichtung selbst aufgerüstet werden, um die Fähigkeit zu haben, flüchtige organische Verbindungen, Partikel zu überwachen, und die Konzentrationen an Chlordioxid, die zur Dekontamination eingesetzt wird. Zweitens wird eine Verarbeitungskammer mit einer FACS-Maschine enthält, kann über einen Puffermodul mit dem Rest der Vorrichtung untergebracht und angeschlossen werden. Dies wird für die Zellsortierung und Reinigung von tr ermöglichenansplantable Zellpopulationen unter den entsprechenden Umgebungsbedingungen. Schließlich muss die gesamte Vorrichtung innerhalb einer weichen Wand Reinraum untergebracht werden. Dies sorgt für eine Internationale Organisation für Normung (ISO) Klasse 8 - Umgebung für die Vorrichtung 5. Die hohe Sterilität und computergesteuerten Charakter des CPF macht es zum idealen System für zukünftige Anwendungen mit zellbasierten Therapie und gute Herstellungsverfahren. Das Risiko einer Kontamination stark abgeschwächt, aber noch wichtiger, sind die Bedingungen für die Zellexpansion automatisch erfasst und durch das Computersystem archiviert. Abweichungen in Gaskonzentrationen, Temperatur, Feuchtigkeit und allen Ereignissen des Zugangs in das System werden rigoros dokumentiert. Dies kann erheblich dazu beitragen, wenn das Produkt Qualitätsprobleme zu untersuchen. Jedoch gibt es immer noch Beschränkungen auf. Die Verwendung von irgendwelchen und allen Reagenzien und Verbrauchsmaterialien (zB Medienkomponenten, Pipetten, Platten) sind separat zu dokumentieren. Hinzufügenitionally, gibt es eine Vielzahl von möglichen Problemen (einschließlich vieler Formen menschlicher Fehler), die durch das Überwachungssystem entstehen können, welche die CPF dokumentiert den Variablen völlig unabhängig sind. Somit bleibt der Bedarf an hoch qualifiziertes Personal und ausführliches Handbuch Dokumentation von Aufgaben an Ort und Stelle.

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations. 
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo System&lt;/i&gt;</td><td>Biospherix</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo&lt;/i&gt; Software</td><td>Biospherix</td><td>version i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Microscope with DP21 camera and fluorescence</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Sodium</td><td>Hyclone</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Protide</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s-based Cell dissociation Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Serum Supplement</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumable Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serological pipet</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 flask</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 flask</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1,000 pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Dieses Manuskript beschreibt im Detail eine Zelle Produktionsstätte, und die einzigartigen Aspekte von Zellen in einem geschlossenen System kultiviert werden. Der Großteil der Zellproduktionsstätte umfasst eine maßgeschneiderte, beiliegend, Zellkulturvorrichtung , die eine kleine Stellfläche und lässt sich in 6 x 7,5 m 2 Zimmer (2) untergebracht werden. Zu keinem Zeitpunkt sind die Zellen innerhalb der Vorrichtung ausgesetzt Laborpersonal oder der Umgebung. Die Vorrichtung besteht aus mehreren Modulen: eine Prozesskammer, eine Laminarströmungshaube, 2 Pufferung Schleusenkammern zwischen der Haube und der Prozesskammer, zwei Zellkultur - Inkubatoren, und einem Mikroskopkammer benachbart zu der Prozesskammer (3). Das System wird durch Software gesteuert , so dass Umgebungsvariablen (Figur 1) gesteuert und überwacht werden. Der Computer mit dieser Software läuft auf einer unterbrechungsfreien Stromversorgung. Die Gase werden in th gefüttertE - System durch eine Reihe von Verteilern für Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxid (Abbildung 4). Gase für das Gerät sind durch Verteilersysteme geliefert, die zwei Sätze von Tanks haben jeweils - ein aktives Set und ein Reservesatz. Wenn der aktive Satz wird nach unten gezogen, schaltet der Verteiler automatisch an die Reserve eingestellt und das Personal Tanks, um Ersatz. Die Leistung ist auf einem Backup-Generator-System. Pluripotente und neurale Stammzellen können in hypoxischen Bedingungen in dieser Anlage unter Verwendung von zuvor entwickelten Protokolle 9, mit den zusätzlichen Komplikationen inhärenten dem neuen Gerät angebaut werden. Pluripotente Stammzellen können mit Sendai-Virus abgeleitet werden, Pluripotenz-spezifische Antikörper unter Verwendung von vollständig transfizierten Kolonien zu identifizieren, die dann isoliert und expandiert. (5A und B), Aus diesen iPSCs, neuralen Stammzellen und Neuronen kann mit dual SMAD Inhibierung abgeleitet werden, und deren Phänotyp prüft usi<html> ng NSC-spezifischen Antikörpern (5C und D). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Abbildung 1. Grafische Oberfläche für die Zellproduktionsanlage. (A) Die graphische Darstellung des CPF ist der Standardbildschirm und stimmt mit der CAD - Zeichnung in Abbildung 3 dargestellt. Ein Klick der Maus über das Puffermodul 1 (2F in Abbildung 1) öffnet seine Kontrollbildschirm (B) , wobei O 2 Werte eingestellt werden , um die Bearbeitungskammer (3 in Abbildung 3) zu entsprechen. In ähnlicher Weise auf der Prozess klicken Kammer oder Incubator 1 bringt ihre jeweiligen Steuerbildschirme (C bzw. D), wo Werte geändert werden können , oder in angemessener Weise überwacht.<html> rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Zellproduktionsanlage. (A) Das System , wie aus einer Ansicht von vorne rechts gesehen. Beachten Sie die Strom- und Gasanschlüsse in der Decke und den Wagen mit den Mikroskop-Zubehör und Computer auf der rechten Seite. (B) Die Laminarströmungshaube mit den Zugangstüren zu den Puffermodulen an der rechten Seite zu sehen. (C) Die Prozesskammer mit den beiden Inkubatoren (schwarze Türen) auf der Rückseite gesehen. (D) Ein Blick durch die rechte Seite des Systems , das Mikroskop zeigt und Monitor mit den Türen zu den Pufferkammern in der Ferne zu sehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein CAD ​​- Zeichnung der Zellproduktionsanlage. Alle Einzelteile in das Gerät gelangen zunächst mit Alkohol und luftgetrocknet , in der Laminar - Flow - Haube (1) abgewischt. Die Artikel werden dann auf die geeignete Atmosphäre im vorderen Puffermodul (2F) überführt, bevor sie in das UCPC Modul übergeben wird, oder Prozesskammer (3). Zellen werden in den beiden Inkubatoren (4, 5). Lebendzellfärbung, Kolonie Kommissionierung, die Beurteilung der allgemeinen Zellmorphologie und Migrationsanalyse erfolgt in der UPC - Modul oder Mikroskopkammer (6). Schließlich Abfall das System durch den hinteren Puffermodul (2R) austritt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Abbildung 4. Quellen von Gasen und Energie. (A) Die CO 2 Verteiler ist ein 4 x 4 - Setup , da es alle Inkubatoren des Labors liefert. (B) Der O 2 Verteiler ist ein 2 x 2 - Setup und liefert nur die Zellproduktionsanlage. Stickstoff für das System wird in einem Verdampfer erzeugt wird (C, knapp unterhalb des Ausgangszeichen) , die an einem flüssigen Stickstoffverteiler (nach rechts) , die auch cryofreezers (unten links) füllt automatisch. Der Verteiler ist ein 2 x 2-Setup durch zwei Paare von 160 L flüssigem Stickstoff Tanks zugeführt wird. CO 2, O 2 und N 2 werden von der Decke durch Absperrungen (D) zugeführt wird . Hausvakuum wird auch an dieser Stelle zugeführt wird. Gesehen direkt hinter den Versorgungsgasabschaltungen ein Paar von Stromkabeln, die Stromversorgung des Systems liefern.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Abbildung 5. pluripotenten Stammzellen in Hypoxie mit Sendai - Virus stammt. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (Nomenklatur in Stover gefunden et al. 9), Phasenkontrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs Live-gefärbt mit AF-594-markiertem Tra-1-60, 1: 100 Verdünnung in Medien. Alle iPSCs wurden in der Zellproduktion in 5% O 2 mit Sendai - Virus transduziert. (C) Phasenkontrast-SC68.1 UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC abgeleitetes NSC, bei 5% O 2 in chamber slides gezüchtet. Die Zellen wurden dann in 4% Paraformaldehyd fixiert und mit anti-human Nestin primären Antikörper und Alex-488 sekundärem Antikörper gefärbt. Alle Maßstabsbalken sind bei 100. 1, m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

culturing-human-pluripotent-neural-stem-cells-an-enclosed-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K Aufrufe.  Childrens Hospital of Orange County Research Institute. Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Serie: Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Passagierung humaner neuraler Stammzellen

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Biologie

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Neurowissenschaften

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Induzierte Differenzierung pluripotenter Stammzellen mit Hilfe eines automatisierten Kultursystems

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Autor im Rampenlicht: Automatisierung der iPSC-Kultur für verbesserte Reproduzierbarkeit 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Embryonales Mausgehirn mischte Zellkulturen, um Infektionen und angeborene Immunität zu untersuchen

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

Autor im Rampenlicht: Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

Zusammenfassung

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