Name: high content screening analysis to evaluate the toxicological effects of harmful and potentially harmful constituents (hphc)
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
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Die Autoren möchten sich Karsta Luettich und Grégory Vuillaume für ihre Überprüfung des Manuskripts danken.

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Alle Autoren sind Mitarbeiter von Philip Morris International. Philip Morris International ist die einzige Quelle für die Finanzierung und Sponsor dieses Projekts.

Der Bedarf an Alternativen zu Tierversuchen und für neue Hochdurchsatz-Testmethoden wurden in den vergangenen Jahren viel diskutiert. Dies hat Wissenschaftler und Regulierungsbehörden geführt alternative Methoden für Standardtoxizitätstests zu untersuchen, zellulären Assays verwendet, die die Physiologie der Zielgewebe eng imitieren. In dieser Studie haben wir die Anwendbarkeit der Kombination eines Echtzeit-Zell Analysator (RTCA) mit einem hohen Gehalt Screening (HCS) Plattform demonstriert die Wirkung der Exposition auf einzelne CS Bestandteile auf die menschliche Lungenepithelzellen zu beurteilen. Diese Einstellung könnte analog Zytotoxizität durch verschiedene andere Luftschadstoffe, Schwebeteilchen und Nanopartikel induziert zu bewerten angewendet. Des Weiteren können die erhaltenen Ergebnisse mit denen von Whole-Genome Transcriptomics und Berechnungsmethoden auf kausale biologischen Netzwerken basieren angepasst werden. Wie bereits berichtet, erlaubt dieser Ansatz uns Daten über molekulare Weg zu erhärtenStörung bei CS Exposition 5 mit HCS - Endpunkte, auch phänotypisch diese Weg Störungen Adressierung. Als Flussdiagramm - Assay bietet Echtzeit - Zellanalyse die Lebensfähigkeit der Zellen bezogenen Informationen in einer dosis- und zeitabhängige Auflösung, die eine bessere Entscheidungsfindung ermöglicht , die Dosis und die Belichtungszeit Punkt für Downstream - Analyse 14 günstig sein kann. Das Prinzip des Analysators beruht auf Veränderungen in der elektrischen Impedanz von den Zellen erzeugt, wie sie befestigen und die Ausbreitung auf einer Oberflächenkultur und mit einer Goldmikroelektrode bedeckt. Die Impedanz wird in einen dimensionslosen Parameter mit dem Namen zell Index umgewandelt, die verwendet werden können, die Zelladhäsion zu überwachen, Verstreuen, Morphologie und letztlich die Lebensfähigkeit der Zellen. Obwohl diese Technik bietet keine Informationen über zytotoxische Mechanismen, seine Empfindlichkeit Erkennung von morphologischen zellulären Veränderungen auch bei sehr niedrigen Dosen, bei denen ermöglicht die HCS nicht informativ ist (Daten nicht gezeigt). Basierend auf Previous Experimenten haben wir festgestellt, dass RTCA Methodik bei niedrigeren Dosen im Vergleich morphologischer Veränderungen zu erkennen in der Lage, die HCS-Endpunkte. Nach anfänglichen Screening mit der Echtzeit-Zellanalyse wurde eine HCS-Plattform zu gewinnen, weitergehende Informationen über die Art der Zytotoxizität von jedem HPHC ausgelöst verwendet. Das Panel HCS-Assay erlaubt HPHCs gegenüber ihren möglichen Auswirkungen auf die zellulären Kompartimenten / Organellen sowie zum Profil wie für den auslösenden Genotoxizität oder oxidativen Stress zu identifizieren. Die Analyse zeigte deutliche Profile, wobei die ausgewählten HPHCs Zytotoxizität in NHBE Zellen induzieren. Im Allgemeinen sind alle Verbindungen mit Ausnahme Phenol wurden gefunden Nekrose bei den höchsten getesteten Dosen zu induzieren. In Übereinstimmung mit einer möglichen Rolle bei der Krebsentwicklung 1-aminonaphtalene induzierte Phosphorylierung von H2AX als Marker für Genotoxizität, relea jedoch die HCS-Panel auch unbedeckten Aktivität dieses HPHC in der mitochondrialen Toxizität Auslesung (Masse erhöht und Cytochrom Cse) und oxidativer Stress (GSH Erschöpfung). In ähnlicher Weise, wie zuvor beschrieben, wurde Phenol identifiziert mitochondriale Dysfunktion zu induzieren, und die DNA-Schäden sowie GSH Verarmungs verursachen. Chrom (VI), einer der klassifizierten Verbindungen als Gruppe I Karzinogene und Crotonaldehyd wurden auch beide als genotoxisch, insbesondere Chrom (VI) auch induzierte Apoptose (Caspase-Kaskade Aktivierung) und Crotonaldehyd identifiziert verursachte ROS erhöht. Schließlich Arsen (V) wurde gefunden cJun-Phosphorylierung zu induzieren, die ein Marker für Stress Kinase-Signalweg-Aktivierung ist. In dieser Studie verwendeten wir NHBE Zellen als Modell für Lungen Epithelzellen in vitro. Unter Verwendung dieser Zellen in einer HCS-Einstellung ist beispiellos und ermöglichte die Untersuchung eines breiteren Spektrums von Endpunkten, einschließlich Genotoxizität und oxidativen Stress-Marker. Sowohl mit lebenden Zellen und feste Zellfärbung Ansätze wurden innerhalb unserer Protokolle beschrieben, die Flexibilität der gesamten Technik zu demonstrieren. in fAkt, die gleichen Protokolle können auf eine breitere Palette von Zielen angewandt werden, die durch die Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffes oder Antikörper behandelt werden können. Für die erfolgreiche Durchführung der Live Färbeprotokollen ist es wichtig, die Reaktionszeit zu beachten, da einige der Farbstoffe eine begrenzte Halbwertszeit und das Fluoreszenzsignal haben kann abnehmen, bevor die Bilderfassung abgeschlossen ist. Es ist auch wichtig zu bedenken, dass, wenn eine andere Zelltyp verwendet wird, werden alle Färbebedingungen sollte, als die optimale Farbstoffkonzentration und der Inkubationsdauer kann unterschiedlich sein neu bewertet werden. In der aktuellen Papier haben wir ein Szenario beschrieben, in dem nur fünf Verbindungen, bei denen mit dem HCS-Methodik untersucht. das zuvor beschriebene Plattenlayout bedenkt, wurden sie über zwei verschiedene Plattensätze für eine Gesamtzahl von 24 Platten (6 Assays und 2 Zeitpunkte) .Die Anzahl der Platten könnte auch erhöht, wodurch die gleichzeitige Screening mehrerer Verbindungen ermöglicht dosierende oder die invessuchung von mehreren Endpunkten. Bevor Sie dies tun, sollte man jedoch berücksichtigen, dass bestimmte Endpunkte (GSH und ROS) erfordern eine sofortige Erfassung, und als Folge, die Dosierung der Platten sollte in einer gestaffelten Art und Weise durchgeführt werden, um den Erwerb der vorherigen Platte zu ermöglichen. Auf der anderen Seite, eine feste Zellfärbung Protokoll stellt einen Vorteil, wenn die Platten gestapelt werden kann, das Protokoll zu jedem Schritt nach der Fixierung zu unterbrechen, für den Abschluss des Färbeverfahrens zu einem späteren Zeitpunkt. Dieser Ansatz, zum Beispiel, würde der Bediener mit der Zeit bieten alle lebenden Zellen Färbeplatten abzuschließen, ohne die Datenqualität zu beeinträchtigen. Um den Arbeitsablauf zu optimieren, indem die Anzahl der Platten abnimmt, wäre es auch möglich sein, mehrere Endpunkte miteinander zu multiplexen. Zum Beispiel in diesem Zusammenhang DNA-Schäden und Stress-Kinase könnte zusammen einfach Sekundär unter Verwendung von zwei mit Fluorochromen Antikörper untersucht werden, in verschiedenen c emittierendenanäle e xistieren. Die kontinuierliche Weiterentwicklung der HCS-Plattform, einschließlich vollautomatischen Zellaussaat, Verbindungsverdünnung, Dosieren und Färbung, sowie das Hinzufügen neuer Endpunkte wird weiter die Fähigkeit der HCS-Plattform als ein leistungsfähiges Profilierungswerkzeug erweitern für HPHCs auf epithelialen und anderen Zelltypen .

Toxikologische Risikobewertung hat sich auf die Verwendung von Tiermodellen historisch verlassen, die zwar grundlegend in den Lebenswissenschaften, auch mit Mängeln wie inkonsistent Übersetzbarkeit auf den Menschen und der hohen Kosten verbunden ist. Darüber hinaus hat es eine zunehmende Anstrengungen zu finden Alternativen zu Tierversuchen in den Geist der &quot;3R&quot; 2 (Replacement, Reduction und Refinement). Dieser Aufwand hat sich in den letzten Jahren beschleunigt, nicht nur wegen der jüngsten Fortschritte wie Hochdurchsatztechniken und Systembiologie, aber wegen der Regelung ebenfalls die Verwendung von Tierversuchen beschränken, insbesondere in der Europäischen Union. Die Komplexität der zellulären Signalwegen die Reaktion auf toxische Beleidigungen Regelung macht es offensichtlich, dass einzelne toxikologische Endpunkte werden nicht ausreichen, um die toxikologische Grundlage bestimmter Verbindungen zu beschreiben. Hierzu wird das Zusammenspiel von Hunderten von in Wechselwirkung proteins an ein biologisches Netz beitragen wird ebenfalls berücksichtigt werden müssen. Um die Wirkung von Giften in diesen Netzwerken zu studieren, ein System Toxikologie Ansatz kombiniert mit phänotypischen Mittel- und Hochdurchsatz-Screening-Assays ist nützlich Potenzen zu schließen und gleichzeitig die weitere Informationen über die Wirkungsweise der einzelnen Noxen bereitzustellen. In dieser Studie verwendeten wir HCS als ein leistungsfähiges Screening-Tool, das aus einem automatisierten Mikroskop und einer biologischen Softwareanwendung zusammengesetzt ist, die, zu verarbeiten und zu analysieren Bilddaten aus den spezifischen fluoreszenzbasierten zellulären Assays können erwerben. Dies ermöglicht eine visuelle Veränderungen innerhalb einer Zelle in einer einzelnen Zelle oder subzellulären Ebene quantifiziert werden, und viele Parameter gleichzeitig zu analysieren. 3 beispielsweise DNA - Doppelstrangbrüche wurden auf Antikörper-Basis Identifizierung von Histon H2AX Phosphorylierung ausgewertet und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wurden unter Verwendung eines zell perm quantifizierteable Superoxid-empfindlichen Farbstoff. Da Epithelzellen der Lunge die erste biologische Barriere gegen inhalativen Noxen darstellen, einschließlich Zigarettenrauch, verwendeten wir primären bronchialen Epithelzellen als in - vitro - Modell die Wirkung von HPHCs von der US - amerikanischen Food and Drug Administration veröffentlicht zu profilieren. 4 Dieses Manuskript eine Folge ist -bis auf einer früheren Studie 5 , bei dem man die biologische Wirkung einer unterschiedlichen Untergruppe von HPHCs ausgewertet. Im Rahmen unserer Workflow - Zytotoxizität in vitro zu beurteilen, zunächst wir die Potenzen einer Auswahl von 15 HPHC des ausgewertet, eine Impedanz-basierte Echtzeit - Zellanalyse (RTCA) System , das uns Dosisbereiche, geeignet für die anschließende HCS zu etablieren erlaubt Analyse (Abbildung 1). Eine toxikologische HCS Beurteilung wurde dann neun multiparametrisches Endpunkte zellulärer Toxizität durchgeführt unter Verwendung von jeweils zu zwei Zeitpunkten überwacht werden (4 und 24 h). Die Marker verwendet wurden , indikativ für mitochondriale Toxizität, DNA - Schäden, Stresskinase, reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Glutathion (GSH) -Gehalt, Caspase 3 bis 7 - Aktivität, Cytochrom C Freisetzung und Zellmembranpermeabilität, wie in Tabelle 1 beschrieben. Unser Ansatz ermöglicht Identifizierung und Charakterisierung der Wirkung von Zigarettenrauchbestandteile durch dosis- und zeitabhängige Probenahme. Letztlich ergibt sich daraus eine In - vitro - Toxizitätsprofil für jeden HPHC. Multi-omics Ansätze können auch verwendet werden, um die HCS-Analyse ergänzen. Dies würde schließlich auch ein tieferes Verständnis für die Auswirkungen auf die Zellsignalisierung und / oder Transkriptionsebene.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td>05331625001</td><td></td></tr><tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY counter TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Cardio Temperature Tool</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealer breathseal</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>non-smoking 60-year-old Caucasian male donor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture Reagents kit</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask filter cap 75&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96 well assay plate&amp;nbsp; black&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (For Far Red Nuclear Staining)</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Dye: Monochlorobimane</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>GSH Dye: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: YO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Y3603</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3602</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TOTO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3600</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Cytochrome C antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG DyLight 650&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x permeabilization buffer</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% Formaldehyde solution</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>10x blocking buffer</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Ethacrynic acid</td><td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>1-Aminonaphthalene</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>2-Nitropropane</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetamide</td><td>Sigma</td><td>695122</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Arsenic (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Benzene</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Chromium (VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Crotonaldehyde</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Methyl ethyl ketone</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nickel&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nitrobenzene</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Quinoline</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Toxic</td></tr></tbody></table>

high content screening analysis to evaluate the toxicological effects of harmful and potentially harmful constituents (hphc)

Zigarettenrauch (CS) ist ein wichtiger Risikofaktor für Herz-Kreislauf- und Lungenerkrankungen. Da CS ist ein komplexes Aerosol mehr als 7.000 Chemikalien , die 1 es die Beiträge der einzelnen Bestandteile zu seiner Gesamttoxizität zu bewerten ist eine Herausforderung. Toxikologische Profile der einzelnen Bestandteile sowie Gemische können jedoch in vitro hergestellt werden, durch Hochdurchsatz-Screening - Tools anwenden, die die Profilierung von gefährlichen und potenziell gefährlichen Inhaltsstoffe (HPHCs) von Tabakrauch zu ermöglichen, wie sie in der US - amerikanischen Food and Drug definiert Administration (FDA). 2 Für eine erste Einschätzung, ein impedanzbasierten Instrument wurde für eine Echtzeit, markierungsfreie Beurteilung der Verbindung der Toxizität verwendet. Das Instrument zeigt beruht auf Zelladhäsion, Lebensfähigkeit und Morphologie, die alle zusammen einen Überblick über den Zellstatus bereitzustellen. Ein dimensionsloser Parameter, Zellenindex genannt, wird für die Quantifizierung verwendet. Eine Reihe von difdene Färbeprotokollen wurde für eine Fluoreszenz-Imaging-basierte Untersuchung und eine HCS-Plattform verwendet wurde entwickelt, weitergehende Informationen über die Art der Zytotoxizität von jedem HPHC ausgelöst zu gewinnen. Von den 15 getesteten Bestandteile wurden nur fünf ausgewählt für HCS-basierte Analyse , da sie eine berechenbare LD 50 (&lt;20 mm) registriert. Dazu gehörten 1-aminonaphtalene, Arsen (V), Chrom (VI), Crotonaldehyd und Phenol. Auf der Grundlage ihrer Wirkung in dem HCS, 1-aminonaphtalene und Phenol kann mitochondriale Dysfunktion zu induzieren, identifiziert werden, und zusammen mit Chrom (VI) als genotoxisch basierend auf der Histon H2AX Phosphorylierung erhöht. Crotonaldehyd wurde als oxidativen Stress Induktor und Arsen als Stress-Kinase-Weg-Aktivator identifiziert. Diese Studie zeigt , dass eine Kombination von impedanzbasierten und HCS Technologien zur in vitro Bewertung der CS Bestandteile ein robustes Werkzeug zur Verfügung stellt.

RTCA Da die HCS - Endpunkte nicht informativ sein wird , wenn keine toxische Wirkung festgestellt wird, sind solche Verbindungen nicht zeigen verminderte Lebensfähigkeit der Zellen bis zur höchsten Konzentration in der RCTA nicht durch HCS (3b getestet, c, d, g, k, l, m , p). Verbindungen zeigt verminderte Lebensfähigkeit der Zellen bei nur der höchsten Konzentration (Abbildung 3e, o) sind auch für die HCS abgewählt. Schließlich sind nur die Bestandteile mit einem berechenbaren LD 50 (&lt;20 mM) werden für die weitere Analyse HCS (3a, f, h, j, n) ausgewählt. HPHCs die oben genannten Kriterien erfüllen, sind: 1-aminonaphtalene, Arsen (V), Chrom (VI), Crotonaldehyd und Phenol. HCS Als Qualitäts-Check (QC), sind positive Kontrollen first analysiert, dass Färbeverfahren, um sicherzustellen, richtig ausgeführt wird. Repräsentative Bilder von Positivkontrolle behandelten Zellen werden in 6 gezeigt. Die Datenwerte werden auf die Fahrzeug normalisierten wie zuvor beschrieben. Keine Dosis-Wirkungskurven werden dargestellt als nur drei Dosen getestet werden und nicht alle drei Dosen werden bei jedem Zeitpunkt betrachtet. Die Positivkontrollkonzentrationen ausgewählt werden (basierend auf früheren Versuchen, Daten nicht gezeigt), so dass geeignete Antworten für jeden Endpunkt sowohl auf 4 Stunden und 24 Stunden beobachtet werden. Insbesondere Dosen 1 und 2 werden verwendet, um die Wirkung bei 4 h zu bewerten, während die Dosen 2 und 3 werden verwendet, um die Wirkung bei 24 Stunden auszuwerten. Die Platten werden verworfen, wenn keine Antwort für die positive Kontrolle Dosen beobachtet wird. Man beachte, dass für alle Endpunkte, außer mitochondrialen Membranpotentials und GSH-Gehalt wird eine Erhöhung der Signalintensität erwartet. Alle Verbindungen, mit Ausnahme von Phenol, führte zu einer nekrotischen Phäno<html> Typ, basierend auf erhöhte Permeabilität der Zellmembran (7a, f, h, l). 1-aminonaphtalene, Chrom (VI), Crotonaldehyd und Phenol wurden als genotoxisch basierend auf erhöhte Phosphorylierung von Histon H2AX (7e, j, n, p) identifiziert. Phenol und 1-aminonaphtalene wurden zu induzieren starke mitochondriale Dysfunktion (7b, o) gefunden, die mit 1-aminonaphtalene, führte zu einer erhöhten Freisetzung von Cytochrom C (Abbildung 7c). Der Nachweis von erhöhten Caspase 3/7 Aktivität zur Verfügung gestellt Nachweis von apoptotischen Ereignisses auf Chrom-Exposition. Oxidativer Stress Induktion (ROS oder GSH) wurde auch bei der Behandlung mit 1-aminonaphtalene nachgewiesen, Crotonaldehyd und Phenol (7d, m, q). Schließlich induziert Arsen Zellstress durch die erhöhte Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors cJun (Figur 7G) zeigten als. Last / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Verbindung Tox-Profiler - Workflow. A) Schematische Darstellung des Workflow folgte in dieser Studie. Zunächst wurde eine Dosis-Entfernungsmessung durchgeführt , die RTCA - Plattform unter Verwendung von geeigneten Dosen zu wählen für nachfolgende HCS die substanzspezifischen Toxizitätsprofile. B) Experimentelles Design der Studie zu charakterisieren. 24 Stunden nach dem Aussäen wurden die Zellen dosiert und Impedanzwerte kontinuierlich über die folgenden 24 Stunden überwacht, während HCS Endpunkte untersucht wurden 4 und 24 Stunden nach der Dosierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Abbildung 2. RTCA Belichtungsplatte. Compound Masterplatte zuerst durch die Durchführung einer fünfstufigen 01.10 serielle Verdünnung erzeugt wird. Jede Verbindung,die Fahrzeugsteuerung einschließlich (Dosis 0) wird dann mit Medium und Staurosporin als Kontrollen in dreifacher Ausfertigung an die Belichtungsplatte zusammenaddiert. Beachten Sie, dass die Dosen - Sequenz bei der Übertragung beibehalten wird, höchsten Dosen in Zeilennummer 1 sind , während Fahrzeugsteuerungen sind in der Reihe Nummer 7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen Bitte hier klicken.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Figure 3. Repräsentative RTCA Zell Viability Ergebnisse. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropan, c) acetamid, d) Aceton, e) acrylamid, f) Arsen (V), g) benzol, h) Chrom (VI) , j) Crotonaldehyd, k) Methylethylketon, l) Nickel (II), m) Nitrobenzol, n) Phenol, o) Chinolin, p) Toluol. Bei 24 Stunden nach der Dosierung, die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde für jede Dosis berechnet (einschließlich positive Kontrolle und Fahrzeug) und normalisiert in einem Bereich von 0 bis -100% Wirkung (y-Achse), wobei 0 die Aktivität widerspiegelt das Fahrzeug und -100 der positiven Kontrolle. Die Werte wurden dann aufgetragen und ausgestattet , um eine Vier-Parameter - Hill - Gleichung und, wenn möglich, LD 50 berechnet wurde. Die Konzentrationen werden auf einer logarithmischen Skala ausgedrückt (x-Achse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Abbildung 4. Verdünnungsschema für Positivkontrolle Verbindungen für HCS - Assays. A) Die Zugabe von Positivkontrollen und vezeug an die serielle Verdünnungsplatte. b) Serielle Verdünnung der positiven Kontrollen. c) 200X positive Kontrollen Dosen. de) Verdünnung der 200x positiven Kontrollen Dosen in Medium (01.40) , um die positive Steuerplatte zu erzeugen , um die 5 - fach - Dosen enthalten. Beachten Sie, dass jede Dosis wird in dreifacher Ausführung verdünnt , um das endgültige Layout in der Belichtungsplatte zu reflektieren). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Abbildung 5. HCS Belichtungsplatte. Compound Masterplatte zuerst durch die Durchführung einer fünfstufigen Verdünnung erzeugt wird. Jede Verbindung, einschließlich der Fahrzeugsteuerung (Dosis 0) wird dann in dreifacher Ausführung zu der Belichtungsplatte zusammen mit den positiven Kontrollen hinzugefügt. Beachten Sie, dass die Dosen, um bei der Übertragung beibehalten wird,höchsten Dosen sind in der Zeile Nummer 1 , während Fahrzeugsteuerungen in Zeilennummer 7. sind <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">hier Bitte klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Abbildung 6. Repräsentative Fluorescent Fotos von Antikörper- oder Dye-gefärbten Zellen a) Kernparameter - Nuclear Farbstoff. Ein durchlässiges Farbstoff, der in lebenden oder fixierten Zellen an DNA bindet. Dieser Fleck wird verwendet , um einzelne Zellen zu identifizieren , die Kernregion Kennzeichnung b) Nekrosen - Permeabilität der Zellmembran Farbstoff. Farbstoff-basierte Erkennung von Zellmembranintegrität. Reagenz ist intrinsisch undurchlässig für die Zellmembran. Während Nekrose, wird die Membran durchlässig und der Farbstoff in die Zelle und bindet an DNA eine starke Fluoreszenz s Herstellung. ignal c) Apoptosis - Cytochrome C: Antikörper-basierte Erkennung von Cytochrom C Freisetzung, einem bekannten Markenzeichen der frühen Apoptose. Nach der Induktion der Apoptose wird Cytochrom c aus den Mitochondrien freigesetzt und diffundiert in den Kern d) DNA Damage - pH2AX:.. Antikörper-basierte Detektion der Phosphorylierung von Histon H2AX, ein wohlbekanntes Merkmal der Doppelstrang - DNA - Brüche e) Stress Kinase - cJun-. Antikörper-basierte Erkennung von Phosphorylierung an Ser-73 von cJun-, einem bekannten Markenzeichen der zellulären Stress f) Oxidativer Stress - DHE: Farbstoff-basierte Erkennung von Superoxid - Radikalen. Dihydroethidium selbst fluoresziert im Zytoplasma blau , während die oxidierte Form Ethidium- auf DNA - Einlagerungs rot fluoresziert g) GSH - MBCL. Farbstoffbasis Nachweis freier GSH - Moleküle. MBCL reagiert mit GSHerzeugen ein hoch fluoreszierendes Produkt h) Apoptosis - Caspase 3/7 Aktivierung:. Dye-basierte Erkennung von Caspase 3/7 Aktivität. Reagenz ist nicht fluoreszierend mit einer Vier-Aminosäure-Peptid, das die DNA-Bindung hemmt. Bei der Caspase-3/7 Aktivierung wird das Peptid ermöglicht den Farbstoff gespalten, um DNA zu binden und eine helle, fluorogene Reaktion erzeugen. Panels bh positive Kontrolle behandelten Zellen zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Abbildung 7. Repräsentative Ergebnisse HCS. 1-aminonaphtalene (ae), Arsen (V) (f und g), Chrom (VI) (hk), Crotonaldehyd (ln) und Phenol (OQ). 4 Stunden (blaue Linie) und24 hr (orange Linie) Signale wurden für jede Dosis und normiert auf die Fahrzeugaktivität (0%) berechnet. Werte, die nicht in Kurvenanpassung Berechnungen enthalten sind grau dargestellt. Die Konzentrationen werden auf einer logarithmischen Skala ausgedrückt (x-Achse). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Probe </td><td> Endpoint # </td><td> Biologische Endpunkt </td><td> Zellkompartiments </td><td> der Ausgabe </td></tr><tr><td rowspan="4"> Zytotoxizität </td><td> 1 </td><td> Mitochondriale Masse 6 </td><td> Zytoplasma </td><td> Spot-Durchschnitt Bereich </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Mitochondriale Membranpotential 6 </td><td> Zytoplasma </td><td> Punkt mittlere Intensität </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Cytochrome C-Release <sup&gt; 7 </td><td> Kern </td><td> Durchschnittliche Intensität </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Zellmembranpermeabilität 8 </td><td> Kern </td><td> Durchschnittliche Intensität </td></tr><tr><td> DNA-Schäden </td><td> 5 </td><td> Phospho-H2AX 9 </td><td> Kern </td><td> Durchschnittliche Intensität </td></tr><tr><td> Stress-Kinase </td><td> 6 </td><td> Phospho-cJun- 10 </td><td> Kern </td><td> Durchschnittliche Intensität </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> Kern </td><td> Durchschnittliche Intensität </td></tr><tr><td> GSH-Gehalt </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> Zytoplasma </td><td> Punkt mittlere Intensität </td></tr><tr><td> Apoptosis </td><td> 9 </td><td> Caspase 3 13 </td><td> Zytoplasma </td><td> Punkt mittlere Intensität </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Liste der HCS einssays und Endpunkte. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> Fahrzeug </td><td colspan="6" rowspan="2"> RTCA Dosen (uM) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> HCS Dosen </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> Die Lebensfähigkeit der Zellen ausgewählten (uM) </td><td> 3R4F (nM) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-Aminonaphtalene </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 280 &amp; mgr; M </td><td> 2000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitropropan </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acetamide </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Aceton </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acrylamide </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arsen (V) </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 160 &amp; mgr; M </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0,17 </td></tr><tr><td colspan="2"> Benzol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Chrom (VI) </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 20 &amp; mgr; M </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 10 </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td colspan="2"> Crotonaldehyd </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 200 &amp; mgr; M </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Methyl-Ethyl Ketone </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt;20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Nickel </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> nitrobenzol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phenol </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 2300 &amp; mgr; M </td><td> 5000 </td><td> 2000 </td><td> 1000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> Chinolingelb </td><td> EtOH </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Toluol </td><td> Wasser </td><td> 20.000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Liste der getesteten HPHC Verbindungen mit Relative LD 50 bei 24 Stunden der Behandlung. Die Verbindungen für HCS - Analyse ausgewählt werden orange markiert und getesteten Dosierungen sind ebenfalls angegeben. Die 3R4F Dosis ist auf die Menge des Bestandteils in der Rauch von einem Stock von der Referenz Zigarette 3R4F gleichwertig. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Probe </td><td> Verbindung </td><td> Stammlösung </td><td> Lösungsmittel </td&gt; <td colspan="3"> Dosis (s) (uM) </td></tr><tr><td> Zellengesundheit </td><td> Staurosporin </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> Zytotoxizität </td><td> Valinomycin </td><td> 10 mM </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DNA-Schäden </td><td> Paraquat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Stress-Kinase </td><td> Anisomycin </td><td> 2 mM </td><td> DMSO </td><td> 10 </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> Rotenon </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> GSH-Gehalt </td><td> Ethacrynsäure </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Apoptosis </td><td> Staurosporin </td><td> 40 mM </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Liste der positiven Kontrollen und Konzentrationen für jeden Test verwendet.

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High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

High Content Screening-Analyse die toxikologischen Wirkungen von gefährlichen und potenziell gefährlichen Inhaltsstoffe (HPHC) zur Bewertung

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

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Research

JoVE Journal

Biology

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

12.1K Aufrufe.  Philip Morris International R&D. The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds. 

Serie: High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Menschliche pluripotente Stammzelle Basierend Entwicklungstoxizität Assays für chemische Sicherheit Screening und Systembiologie Datengenerierung

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been hindered partly due to a lack of standardized methods and availability of robust, user-friendly technology. In this study, commercially available, division-arrested cell lines were employed to quantitatively screen for endocrine activity of chemicals present in water samples of interest to environmental quality professionals. A single, standardized protocol that included comprehensive quality assurance/quality control (QA/QC) checks was developed for Estrogen and Glucocorticoid Receptor activity (ER and GR, respectively) using a cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Samples of treated municipal wastewater effluent and surface water from freshwater systems in California (USA), were extracted using solid phase extraction and analyzed for endocrine activity using the standardized protocol. Background and dose-response for endpoint-specific reference chemicals met QA/QC guidelines deemed necessary for reliable measurement. The bioassay screening response for surface water samples was largely not detectable. In contrast, effluent samples from secondary treatment plants had the highest measurable activity, with estimated bioassay equivalent concentrations (BEQs) up to 392 ng dexamethasone/L for GR and 17 ng 17&#946;-estradiol/L for ER. The bioassay response for a tertiary effluent sample was lower than that measured for secondary effluents, indicating a lower residual of endocrine active chemicals after advanced treatment. This protocol showed that in vitro transactivation bioassays that utilize commercially available, division-arrested cell &#34;kits&#34;, can be adapted to screen for endocrine activity in water.

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Screening für Endokrine Aktivität in Wasser unter Verwendung von handelsüblichen<em&gt; In Vitro</em&gt; Trans Biotests

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

Umwelt

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identifizierung von pro- und Polyfluorinated chemische Spezies mit einem kombinierten gezielte und nicht gezielte Screening hochauflösende Massenspektrometrie-Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

High-Throughput und umfassende Droge-Überwachung mittels Massenspektrometrie Multisegment-Injektion-Kapillar-Elektrophorese

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Chemie

A High-Throughput Screening Approach for Evaluating the Binding Affinity of Environmental Pollutants to Nuclear Receptors

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite their high environmental occurrence, there is very limited information regarding their toxicological effects. It is urgent to develop high-throughput screening (HTS) methods to guide toxicological studies. In this study, a receptor-ligand binding assay using an HTS system was developed to determine the binding potency of environmental pollutants on nuclear receptors. The test is conducted using a microplate reader (i.e., a 96-well plate containing various chemicals) by measuring the fluorescence polarization (FP) of a specific fluorescent probe. This assay consists of four parts: the construction and transformation of recombinant vectors, the expression and purification of the receptor protein (ligand-binding domain), receptor-probe binding, and competitive binding of chemicals with the receptor. The binding potency of two environmental pollutants, perfluorooctanesulfonic acid (PFOS) and triphenyl phosphate (TPHP), with peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR&#947;) was determined to illustrate the assay procedure. Finally, the advantages and disadvantages of this method and its potential applications were also discussed.

This protocol describes a high-throughput screening system that uses fluorescence polarization of a specific fluorescent probe binding to a nuclear receptor as a readout for screening environmental pollutants.

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite ...

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells expressing the epidermal growth factor receptor HER2 can be targeted by the anti-HER-2 antibody trastuzumab. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is an important mechanism implicated in the antitumor action of HER-2. Trastuzumab bound to cancer cells can be recognized by the Fc receptors of ADCC effector cells (e.g., natural killer (NK) cells, macrophages, and granulocytes), triggering the cytotoxic activity of these immune cells leading to cancer cell death. We set out to develop an image-based assay for the quantification of ADCC to identify novel ADCC modulator compounds by high-content screening. In the assay, HER2 overexpressing JIMT-1 breast cancer cells are co-cultured with NK-92 cells in the presence of trastuzumab, and target cell death is quantified by automated microscopy and quantitative image analysis. Target cells are distinguished from effector cells based on their EGFP fluorescence. We show how compound libraries can be tested in the assay to identify ADCC modulator drugs. For this purpose, a compound library test plate was set up using randomly selected fine chemicals off the lab shelf. Three microtubule destabilizing compounds (colchicine, vincristine, podophyllotoxin) expected to interfere with NK cell migration and degranulation were also included in the test library. The test screen identified all three positive control compounds as hits proving the suitability of the method to identify ADCC-modifying drugs in a chemical library. With this assay, compound library screens can be performed to identify ADCC-enhancing compounds that could be used as adjuvant therapeutic agents for the treatment of patients receiving anticancer immunotherapies. In addition, the method can also be used to identify any undesirable ADCC-inhibiting side effects of therapeutic drugs taken by cancer patients for different indications.

This protocol presents an automated, image-based high-throughput technique to identify compounds modulating natural killer cell-mediated breast cancer cell killing in the presence of a therapeutic anti-HER-2 antibody.

High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

Krebsforschung

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorische Wirkung von Substanzen im menschlichen Precision-Cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Immunologie und Infektion

Bewertung von MOF-induzierten Änderungen des Zellverhaltens durch elektrische Zell-Substrat-Sensorik

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of MOFs in biomedical and industrial applications has led to concerns regarding their safety. Herein, the profile of a selected MOF, a zeolitic imidazole framework, was evaluated upon exposure to human lung epithelial cells. The platform for evaluation was a real-time technique (i.e., electric cell-substrate impedance sensing [ECIS]). This study identifies and discusses some of the deleterious effects of the selected MOF on the exposed cells. Furthermore, this study demonstrates the benefits of using the real-time method versus other biochemical assays for comprehensive cell evaluations. The study concludes that observed changes in cell behavior could hint at possible toxicity induced upon exposure&#160;to MOFs of different physicochemical characteristics and the dosage of those frameworks being used. By understanding changes in cell behavior, one foresees the ability to improve safe-by-design strategies of MOFs to be used for biomedical applications by specifically tailoring their physicochemical characteristics.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der Bewertung der Reaktion menschlicher Lungenepithelzellen auf metallorganische Gerüste 

The following study evaluates the toxicological profile of a selected metal-organic framework utilizing electric cell-substrate impedance sensing (ECIS), a real-time, high-throughput screening technique.

Elektrische Zell-Substrat-Sensorik zur Echtzeit-Bewertung von toxikologischen Profilen metallorganischer Gerüstverbindungen

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...

High Content Screening-Analyse die toxikologischen Wirkungen von gefährlichen und potenziell gefährlichen Inhaltsstoffe (HPHC) zur Bewertung

Zusammenfassung

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