We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine L&#233;vesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Qu&#233;bec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Facult&#233; de m&#233;decine of Universit&#233; Laval.

Hinweis: Alle Experimente wurden genehmigt und nach den Richtlinien der Institutional Tierethikkommission, in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care-Richtlinien durchgeführt, wie von der Animal Care Committee der Université Laval verabreicht. APP-PS1 männliche Mäuse zwischen 4 und 21 Monate alt verwendet wurden. Diese Tiere wurden unter einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus gehalten bei 22 - 25 ° C mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. 1. Methoxy-X04 Herstellung der Lösung <ol><li> Eine 5 mg / ml Lösung von methoxy-X04 9 durch Lösen methoxy-X04 in eine Lösung von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), 45% Propylenglykol und 45% Natriumphosphat gepufferter Kochsalzlösung (0,9% NaCl in 100 mM Phosphatpuffer , pH 7,4). <ol><li> Mit Hilfe einer Mikrowaage wiegen 5 mg der Methoxy-X04-Verbindung. Unter einem Abzug löst den methoxy-X04 in DMSO und rühren, bis eine klare grünlich Lösung erhalten wird. hinzufügen Nacheinander Propylenglykol und phosphate Salzpuffer, während mit jeder Zugabe gerührt wurde. </li><li> Rühren Sie die Lösung bei 4 ° C auf einem Rotator O / N. Besorgen Sie sich eine gelblich-grüne Emulsion. Die Lösung kann bis zu zwei Monate ohne Verschlechterung bei 4 ° C gelagert werden. </li></ol></li></ol> 2. Methoxy-X04-Lösung Injection <ol><li> 24 Stunden vor der Perfusion, wiegen die Mäuse und geben Sie jeder Maus eine intraperitoneale Injektion von Methoxy-X04 in einer Dosis von 10 mg / kg Körpergewicht über einen 27 ½ G Nadel. </li></ol> 3. transkardialer Perfusion des injizierten Mäusen <ol><li> Am Tag vor der Perfusion, entsprechende Mengen an Kochsalzlösung (PBS), 3,5% Acrolein, und 4% Paraformaldehyd (PFA) phosphat Herstellung von Lösungen 13 und speichert sie bei 4 ° CO / N. Hinweis: Diese werden Lösungen sowohl für die Perfusion und verwendet werden, die Immunhistochemie Pre-Einbettung. Besondere Vorsicht, wenn sie mit Acrolein arbeiten, da sie ätzend und giftig für beide istForscher und die Umwelt. Da zusätzlich Acrolein zu Kunststoff korrosiv ist, verwenden Sie immer geeignete Gläser Acrolein Lösungen herzustellen. </li><li> Am Tag der Perfusion, filtern die PFA und Acrolein durch Grobfilterpapier von 25 um Partikelretention verwendet. </li><li> Während der Perfusion verwenden, um eine peristaltische Pumpe 15 ml PBS zu liefern, 75 ml Acrolein und 150 ml PFA nacheinander in die Maus Zirkulation bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 25 ml / min. Lass Vorsicht walten. Führen Sie die Perfusion streng innerhalb einer Abzugshaube schädliche Dämpfe aus PFA und Acrolein zu vermeiden. <ol><li> So stellen Sie die Pumpe, legen Sie ein Ende in die PBS-Lösung, füllen Sie den Schlauch (hält ca. 15 ml) mit PBS und fixieren eine 25 G geflügelte Blutentnahme Nadel zum anderen Ende. Zu allen Zeiten, sicherzustellen, dass der Schlauch von irgendwelchen eingeschlossene Luftblasen frei ist. </li><li> Das Röhrchen wird direkt in der Acrolein Flasche nach der Perfusion Pumpe mit dem Schlauch gefüllt mit PBS einstellen. </li></ol></li><li> Eineine Maus zu einem Zeitpunkt mit einer 90 mg / kg Körpergewicht Dosis von Natrium-Pentobarbital aesthetize intraperitoneal eine 27 ½ G Nadel injiziert werden. Beurteilen Sie Antworten auf Schwanz / Zeh drückt. Gehen Sie nur, wenn Sie die Maus auf eine solche aversiven, schmerzhafte Reize nicht mehr reagiert. </li><li> Sichern Sie die Maus in der Rückenlage (auf dem Rücken liegend mit dem Gesicht nach oben) durch die Vorderpfoten und hindpaws auf die Arbeitsfläche Taping und sorgfältig das Herz aussetzen, ohne auf andere Organe zu beschädigen. Achten Sie darauf, schnell zu arbeiten, nachdem die Membran Punktierung. <ol><li> Führen Sie einen Schnitt durch die Haut mit chirurgischen Schere entlang der Brustmittellinie kaudal des ribcage beginnen und gehen rostral des Schlüsselbeins. </li><li> Machen Sie zwei zusätzliche seitliche Einschnitte entlang der Basis des ventralen Brustkorbs. bewegen und Stift vorsichtig die beiden Klappen der Haut, so dass Sie sicher, dass die gesamte Brusthöhle zu belichten. </li><li> Halten Sie die Xiphoidbasis mit stumpfen Pinzette die Brusthöhle zu entlarven und die spitzen Schere stabilisierens. Schnitt durch die Membran und Brustkorb, wobei darauf geachtet, zu vermeiden, dass die Lungen Punktierung und weiterhin den clavicles den Einschnitt rostral. Achten Sie darauf, schnell zu arbeiten, nachdem die Membran Punktierung. </li></ol></li><li> reißen Sie vorsichtig den Herzbeutel mit stumpfen Pinzette. Halten Sie das Herz ruhig mit stumpfen Pinzette, schneiden Sie den rechten Vorhof, und starten Sie die Infusion von PBS. einfügen sofort die Blutentnahme Nadel in den linken Ventrikel. </li><li> Perfundieren die Maus mit PBS (in dem Schlauch) gefolgt von 3 min Acrolein (75 ml entspricht) dann 6 min zu PFA Schalter (entsprechend 150 ml). Achten Sie darauf, den Förderstrom zu unterbrechen, bevor Switching-Lösung, Blasen am Eindringen in das Rohr zu verhindern. </li><li> Enthaupten die Maus und extrahieren die feste Gehirn und legen Sie sie direkt in einen Glaskolben mit 4% PFA für mindestens 2 Stunden bei 4 ° C. <ol><li> Um das Gehirn zu extrahieren, verwenden Schere und Pinzette durch die Haut zu schneiden, den Schädel zu belichten. brechen Sie vorsichtig den Schädel open zwischen den Augen, und kleine Stücke davon abplatzen die zugrunde liegende Gehirn aufzudecken. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den freiliegenden Gehirn und Post-Fix mit 4% PFA für weitere 2 Stunden vor Vibratom Schnitte für fortfahren. </li></ol></li></ol> 4. Gehirn Sectioning eine Vibratom Verwendung <ol><li> Waschen Sie die Fest brain 3 mal mit gekühltem PBS. Mit einem scharfen Rasierklinge, entfernen Sie den Riechkolben (es sei denn, diese Region untersucht wird) und schneiden Sie das Gehirn quer in 2 - 3 Stücke von ungefähr gleicher Höhe, die alle gleichzeitig um geschnitten werden kann, um den Vorgang zu beschleunigen. </li><li> Kleben Sie die Stücke von Hirngewebe senkrecht auf die Probenplatte in das Fach gesichert. Stellen Sie sicher, dass die glatte Schnittfläche fest an der Probenplatte klebt und nicht während des Schneideverfahrens verdrängt gelangt. Fügen Sie genug PBS-Lösung in das Fach, bis die gesamte Hirnoberfläche vollständig eingetaucht ist. Es ist wichtig, th zu haltene Gehirn Stücke und nachfolgende Abschnitte vollständig in PBS in diesem Schritt eingetaucht. </li><li> Setzen Sie das Fach in der Vibratom, stellen Sie die Schneidegeschwindigkeit auf 0,5 mm / sec, der Schnittfrequenz auf 90 Hz, und der Speisestärke bis 50 &amp; mgr; m, um 50 &amp; mgr; m dicke Abschnitte zu erhalten. Dann übertragen Sie die Abschnitte in 20-ml-Glasfläschchen mit Gefrierschutzmittel-Lösung (40% PBS, 30% Ethylenglykol und 30% Glycerin) mit einem feinen Pinsel. Lagern Sie die Fläschchen bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung. Alternativ halten die Abschnitte in PBS für die sofortige Screening, wie in den folgenden Schritten beschrieben. </li></ol> 5. Abschnitt Screening auf die Anwesenheit von Methoxy-X04-gefärbten Plaketten <ol><li> Mit der Hilfe eines stereotaktischen Maus - Gehirn - Atlas 14, wählen Gehirnschnitte , die Region von Interesse enthält, zum Beispiel, wie der Hippocampus CA1 in dem vorliegenden Beispiel verwendet. Setzen Sie jeden Abschnitt in einen Brunnen innerhalb einer 24-Well-Kulturplatte genug Gefrierschutzmittel-Lösung, dieum die Abschnitte vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Untersuchen Sie jeden Abschnitt nacheinander, zu vermeiden, dass die Abschnitte Austrocknen, mit dem folgenden Verfahren: <ol><li> Fügen Sie einen Tropfen PBS auf einem Objektträger mit einer Einwegpipette, und legen Sie den Abschnitt auf dem Tröpfchen. </li><li> Überprüfen Sie den Abschnitt unter einem Fluoreszenzmikroskop Regionen zu identifizieren, enthält Methoxy-X04 markierte Aß-Plaques. Hinweis: methoxy-X04 leicht sichtbar gemacht werden kann, einen Fluoreszenz Ultraviolett (UV) Filter (Anregung 340-380 nm). </li></ol></li><li> Machen Sie Bilder von Regionen von Interesse (ROI) im hellen Bereich als auch im Fluoreszenzmodus, ohne den Mikroskoptisch zu bewegen, da jedes Bild den gleichen Bereich in beiden Bereichen, um zeigen, muss die Anwesenheit der Plaques direkt mit dem Strukturbereich zu korrelieren von der Gewebeschnitt. </li><li> Benennen und speichern Sie die Bilder entsprechend der Tiernummer genommen. notieren Sie auch die gut Nummer in der Platte und das Feld der Bilder taken. Zum Beispiel Ex: 9978A1B; Tierzahl: 9978; Nun Nummer: A1; Field: Bright. Platzieren Sie den Abschnitt wieder in seiner vorgesehenen gut, wenn die Bildgebung abgeschlossen ist. Hinweis: Am Ende für jeden Abschnitt untersucht, zwei Bilder erhalten werden, ein in Hellfeld und ein weiteres im UV-Bereich. </li><li> Öffnen Sie die beiden Bilder von der gleichen ROI (ein in hellen Bereich und die andere im UV-Bereich) in Bild J, und mit Hilfe der MosaicJ Plugin, richten Sie die Ränder der beiden Bilder und speichern Sie die ausgerichtet und kombinierten Bildes nach der gut Nummer sie kam aus. </li><li> Speichern Sie das Bild in einem separaten Ordner mit der Nummer des jeweiligen Tieres. Kombinieren Sie die Bilder zu identifizieren und die Plaques im Gewebeschnitt zu lokalisieren, und haben einen vollständigen Überblick über den gesamten Abschnitt in den zwei verschiedenen Feldern (hell und UV). </li><li> Nach dem Screening-Prozess abgeschlossen ist, speichern Sie die untersuchten Abschnitte bei -20 ° C in einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen enthält, Gefrierschutzmittel, bis die Immunfärbung oder zur weiteren Verarbeitung ca istrried aus. </li></ol> 6. Pre-Embedding Immunostaining für Iba1 Hinweis: Führen Sie die Immunfärbung für Iba1 auf ausgewählten frei schwebenden Abschnitte von auf einem sich langsam bewegenden Wippe bei RT die Platte legen. <ol><li> Gründlich waschen Sie die Abschnitte 3-mal mit etwa 1 ml PBS, jeder Wäsche dauerten 10 min. </li><li> endogene Peroxidasen mit 0,3% Wasserstoffperoxid in PBS-Lösung quenchen für 10 min. Dieser Schritt verhindert, dass nicht-spezifische Peroxidase-Aktivität, was wichtig ist, die Hintergrundfärbung zu vermeiden. </li><li> Waschen Sie das Gewebe in PBS 3 mal für jeweils 10 Minuten. </li><li> Inkubieren der Schnitte in 0,1% Natriumborhydrid in PBS-Lösung für 30 min. Dieser Schritt ist wichtig, um alle verbleibenden Aldehyde aus dem Fixierungsschritt zu reduzieren, und ist besonders wichtig, wenn Acrolein in Gewebefixierung verwendet wird. </li><li> Waschen Sie das Gewebe in PBS 3 mal für jeweils 10 Minuten Zeit und stellen Sie sicher, alle Blasen zu entfernen. </li><li> Blockieren Sie die Abschnitte 1 Stunde.Verschiedene Antikörper können unterschiedliche Sperrzeiten und Lösungen erfordern. Für Iba1 bereiten 10% fötalem Rinderserum, 3% Rinderserumalbumin und 0,01% Triton X-100 in 50 mM Tris-gepufferter Kochsalzlösung Blockierungspuffer enthält, (TBS, pH 7,4). Hinweis: Der Blockierungsschritt unspezifischen Bindung des primären Antikörpers zu verhindern, ist. Die niedrige Konzentration von Triton X-100 ermöglicht geringfügige Permeabilisierung von Membranen für eine bessere Färbung und ist niedrig genug für die meisten ultrastrukturelle Merkmale des Gewebes unter EM zu bewahren. </li><li> Entfernen des Blockierungspuffers von dem Gewebe, und Inkubation in primärem Antikörper-Lösung (Kaninchen-anti-Iba1, verdünnt [1: 1,000] in Blockierungspuffer) bei 4 ° CO / N. </li><li> Waschen in TBS 3 mal für jeweils 10 Minuten Zeit. </li><li> Inkubieren in Sekundärantikörper (Ziege-anti-Kaninchen zu Biotin konjugiert) [1: 200] in 0,05 M TBS für 90 min. </li><li> Waschen in TBS 5 mal für jeweils 5 min. </li><li> Inkubieren in Avidin-Biotin-Komplex-Lösung (Avidin [1: 100], Biotin [1: 100]) in TBSLösung für 1 Std. </li><li> Waschen in TBS 5 mal für jeweils 5 min. </li><li> Reveal die Iba1 Färbung mit 0,05% Diaminobenzidin (DAB) und 0,015% Wasserstoffperoxid in TBS für 8 min. Anmerkung: Der Zeitpunkt des DAB Entwicklung von Protokoll zu Protokoll können variieren und sollten durch schnell Untersuchung der gefärbten Schnitte unter einem Lichtmikroskop bestimmt werden. Hinweis: Für Iba1 sollte man in der Lage sein , klar die Zellkörper und Prozesse der Iba1 befleckten bei 20facher Mikroglia zu visualisieren (Abbildung 2 für repräsentatives Beispiel zu sehen). Seien Sie vorsichtig mit DAB, da es ein bekanntes Karzinogen ist. </li><li> Vermeiden Sie zu entwickeln, indem Sie bitte die Abschnitte Überwachung (wie oben beschrieben) in diesem Schritt. Die Reaktion durch die Abschnitte in gekühlten PB Waschen 5-mal für jeweils 5 min. </li></ol> 7. Verarbeitung für Elektronenmikroskopie <ol><li> Vorbereitung 1% Osmiumtetroxid-Lösung in PBS in einem Glasfläschchen. Osmiumtetroxid ist lichtempfindlich; decken die glass Fläschchen mit Aluminiumfolie, die Lösung vor Licht zu schützen. Seien Sie vorsichtig, Osmiumtetroxid, da es eine sehr gefährliche Chemikalie ist. Führen Sie diese und die folgenden Schritte innerhalb einer Abzugshaube. </li><li> Entfernen Sie die PBS aus den Abschnitten und verteile sie flach einen feinen Pinsel. Führen Sie diesen Schritt ein gut zu einer Zeit, die Abschnitte zu halten vor dem Austrocknen. Achten Sie darauf, die Abschnitte unmittelbar vor der Zugabe von Osmiumtetroxid, als irgendwelche Falten in den Abschnitten zu glätten wird dauerhaft werden und versuchen, Gewebe Post Osmium Fixierung abflachen werden nur die Abschnitte brechen. </li><li> Tauchen Sie die Abschnitte in Osmiumtetroxid 30 min bei RT, Zugabe eines Tropfens von Osmiumtetroxid zu einer Zeit mit einer Transferpipette, auf die Abschnitte verhindern Falten. Decken Sie die gut mit Aluminiumfolie, um die Abschnitte vor Licht zu schützen. Anmerkung: Dieser Schritt legt die Lipide innerhalb der Abschnitte. Das Gewebe erscheint sehr dunkel nach Osmium Postfixierung. </li><li> Während Abschnitte sind in Osmium tetroXide, bereiten Kunststoffharz in einem Einweg-Becher von 20 g Komponente A mischen, 20 g Komponente B, 0,6 g Komponente C und 0,4 g Komponente D der Komponenten in der obigen Reihenfolge kombinieren und mischen sie gut 10 ml serologische Pipette bis eine einheitliche Farbe erhalten. </li><li> Übertragen Sie die hergestellte Mischung auf Aluminium mit einem Gewicht von Gerichten. Sie werden die Gewebeschnitte erhalten, sobald sie entwässert wurden. </li><li> Entwässern die Abschnitte in Konzentrationen von Ethanol für 2 min in der folgenden Reihenfolge zunehmender: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%. </li><li> Zum Entfernen von Restethanol, tauchen die Abschnitte in Propylenoxid 3-mal 2 Minuten jedes Mal. Entfernen Sie die dehydriert Schnitte aus der 24-Well-Kulturplatte in 20 ml Glasfläschchen. Immer Glasfläschchen verwenden, wenn mit Propylenoxid funktioniert, wie es aus Kunststoff löst sich auf, und halten Vorsicht, da es gefährlich ist. </li><li> Verwenden Sie eine gebogene Glaspipettenspitze oder mit einem feinen Pinsel die Abschnitte von Propylenoxid soluti zu übertragenauf in das Harz und O / N für die Infiltration bei RT verlassen. Achten Sie darauf, um das Harz mit Propylenoxid zu verdünnen. </li><li> Einbetten den Abschnitt mit dem Harz auf Poly-Chlor-tri-Fluor-Ethylen (PCTFE) filmsheets: <ol><li> Legen Sie die Aluminium-Wägeschalen mit den Proben in einen 50 - 60 ° C Ofen 10 - 15 Minuten vor dem Einbetten der Abschnitte auf PCTFE filmsheets. </li><li> Wenn Abschnitte Einbettung, arbeiten mit einer Aluminium zu einer Zeit Schüssel mit einem Gewicht. Mit einem feinen Pinsel, malen eine dünne Schicht aus Harz auf ein PCTFE Filmblatt. </li><li> Bewegen eines Abschnitts des Gewebes in einer Zeit von der Aluminiumschale zum PCTFE Filmblatt mit einem Gewicht. Entfernen Sie überschüssiges Harz aus um das Gewebe, wobei darauf geachtet, sie nicht zu stören. </li><li> alle Abschnitte von einem Gericht zum PCTFE Filmblatt mit einem Gewicht, legen Sie eine zweite PCTFE Blatt über die erste nach dem Verschieben ein Sandwich von Gewebe zu schaffen und zwischen zwei Blättern Harz. </li></ol></li><li> Polymerisieren des Harzes in einem Inkubator für 3 Tage bei 55-60 ° C. </li><li> Das Material ist nun bereit für ultradünne Schnitte und ultrastrukturelle Untersuchung, spezielle Techniken, die häufig durchgeführt werden, durch EM Kernanlagen. Lagern Sie die Proben zwischen PCTFE Filmblätter sicher bei RT ohne ultrastrukturelle Abbau. Hinweis: Die nachfolgenden Schritte für die Ultradünnschnitt und Transmissionselektronenmikroskopie Prüfung sind in einem separaten Protokoll 13 erläutert. </li></ol>

<ol>
	<li>Heneka, M. T., Carson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease.">Neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> The Lancet Neurol. 14 (4), 388-405 (2015).</li><li>Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+rejecting+the+amyloid+cascade+hypothesis.">The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis.</a> Nat. Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).</li><li>Heppner, F. L., Ransohoff, R. M., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+attack:+the+role+of+inflammation+in+Alzheimer+disease.">Immune attack: the role of inflammation in Alzheimer disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 16 (6), 358-372 (2015).</li><li>Klunk, W. E., Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Abeta+plaques+in+living+transgenic+mice+with+multiphoton+microscopy+and+methoxy-X04,+a+systemically+administered+Congo+red+derivative.">Imaging Abeta plaques in living transgenic mice with multiphoton microscopy and methoxy-X04, a systemically administered Congo red derivative.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61 (9), 797-805 (2002).</li><li>Liebscher, S., Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peephole+into+the+brain:+Neuropathological+features+of+Alzheimer's+disease+revealed+by+in+vivo+two-photon+imaging.">A peephole into the brain: Neuropathological features of Alzheimer's disease revealed by in vivo two-photon imaging.</a> Front Psychiatry. 3, 26 (2012).</li><li>Fuhrmann, M., Bittner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Cx3cr1+knockout+prevents+neuron+loss+in+a+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).</li><li>Borchelt, D. R., Ratovitski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+amyloid+deposition+in+the+brains+of+transgenic+mice+coexpressing+mutant+presenilin+1+and+amyloid+precursor+proteins.">Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins.</a> Neuron. 19 (4), 939-945 (1997).</li><li>Ly, P. T. T., Cai, F., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+neuritic+plaques+in+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Detection of neuritic plaques in Alzheimer's disease mouse model.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li><li>Sadowski, M., Pankiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+prion+amyloid+deposits+in+vivo.">Targeting prion amyloid deposits in vivo.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 63 (7), 775-784 (2004).</li><li>Bussi&#232;re, T., Bard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+characterization+of+Thioflavin-S-positive+amyloid+plaques+in+transgenic+Alzheimer+mice+and+effect+of+passive+Abeta+immunotherapy+on+their+clearance.">Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance.</a> Am. J. Pathol. 165 (3), 987-995 (2004).</li><li>Rajamohamedsait, H. B., Sigurdsson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+staining+of+amyloid+and+pre-amyloid+peptides+and+proteins+in+mouse+tissue.">Histological staining of amyloid and pre-amyloid peptides and proteins in mouse tissue.</a> Methods Mol. Biol. 849, 411-424 (2012).</li><li>Afkhami, A., Moosavi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorptive+removal+of+Congo+red,+a+carcinogenic+textile+dye,+from+aqueous+solutions+by+maghemite+nanoparticles.">Adsorptive removal of Congo red, a carcinogenic textile dye, from aqueous solutions by maghemite nanoparticles.</a> J. Hazard. Mater. (1-3), 398-403 (2010).</li><li>Tremblay, M. -. E., Riad, M., Majewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+brain+tissue+for+immunoelectron+microscopy.">Preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li><li>Konsman, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates.">The mouse brain in stereotaxic coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).</li><li>Norden, D. M., Muccigrosso, M. M., Godbout, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+priming+and+enhanced+reactivity+to+secondary+insult+in+aging,+and+traumatic+CNS+injury,+and+neurodegenerative+disease.">Microglial priming and enhanced reactivity to secondary insult in aging, and traumatic CNS injury, and neurodegenerative disease.</a> Neuropharmacology. 96 ((Pt A)), 29-41 (2014).</li><li>Tremblay, M. -. E., Stevens, B., Sierra, A., Wake, H., Bessis, A., Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+in+the+healthy+brain.">The role of microglia in the healthy brain.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16064-16069 (2011).</li><li>&#352;i&#353;kov&#225;, Z., Tremblay, M. &. #. 2. 3. 2. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+synapse:+Interactions+in+health+and+neurodegeneration.">Microglia and synapse: Interactions in health and neurodegeneration.</a> Neural Plast. 2013, 425845 (2013).</li><li>DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+correlates+of+cognition+in+dementia:+quantification+and+assessment+of+synapse+change.">Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change.</a> Neurodegeneration. 5 (4), 417-421 (1996).</li><li>Terry, R. D., Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+cognitive+alterations+in+Alzheimer's+disease:+Synapse+loss+is+the+major+correlate+of+cognitive+impairment.">Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease: Synapse loss is the major correlate of cognitive impairment.</a> Ann. Neurol. 30 (4), 572-580 (1991).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll erklärt ein Korrelat Ansatz für dichten Kern Aß-Plaques mit EM-Targeting. Methoxy-X04 in vivo - Injektion ermöglicht eine schnelle Auswahl von Hirnschnitten , die Aß - Plaques enthalten in bestimmten Regionen und Schichten von Interesse, zum Beispiel den Hippocampus CA1, Schichten radiatum und lacunosum-moleculare. Im vorliegenden Beispiel Methoxy-X04 Pre-Screening wurde mit kombinierten Pre-Einbettung immunostaining für Iba1 zu untersuchen, wie verschiedene Mikroglia-Phänotypen mit Syna...

Amyloid Aß Plaquebildung ist die Hauptneuropathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD). Allerdings zunehmende Hinweise darauf , eine wichtige Rolle des Immunsystems in den Krankheitsverlauf 1,2. Insbesondere werden neue Daten aus präklinischen und klinischen Studien etabliert Immundysfunktion als Haupttreiber und Mitarbeiter AD Pathologie. Mit diesen Erkenntnissen zentralen und peripheren Immunzellen haben als vielversprechende therapeutische Ziele für AD 3 entstanden. Das folgende Protokoll verbindet Licht- und Elektronenmikroskopie (EM) neue Einblicke in die Beziehung zwischen Aß Plaqueablagerung und Mikroglia phänotypische Veränderungen in AD zu erzeugen. Dieses Protokoll ermöglicht die Markierung von Aß - Plaques in Mausmodellen von AD in vivo Injektion des Fluoreszenzfarbstoffs unter Verwendung methoxy-X04. Methoxy-X04 ist ein Kongo-Rot-Derivat, das leicht die Blut-Hirn-Schranke überwinden können das Hirnparenchym zu betreten und zu binden β-Faltblättern mit hoherffinity. Da der Farbstoff fluoreszierend ist, kann es für die in vivo Detektion von Aß Plaqueablagerung mit Zwei-Photonen - Mikroskopie 4 verwendet werden. Sobald an Aß gebunden, Methoxy-X04 nicht trennen oder neu verteilen weg von Plaques, und es behält seine Fluoreszenz über die Zeit. Es wird im allgemeinen 5 peripher zu ermöglichen , für die nichtinvasive Bildgebung von Hirndynamik verabreicht. Die Fluoreszenz bleibt auch folgende Aldehyd Fixierung, so dass für Korrelat post-mortem - Analysen, einschließlich der Untersuchung von neuronalen Tod in der Nähe von Aß - Plaques 6. Dieses Protokoll nutzt die Eigenschaften von Methoxy-X04 an Hirnschnitten von APP SWE / PS1A 246e Mäuse wählen (APP-PS1; Koexpression eine doppelte Mutation an APP - Gen Lys670Asn / Met671Leu und menschliche Presenilin PS1-A264E Variante) 7 , die Aß aufweisen Plaques in bestimmten Regionen von Interesse (Hippocampus CA1, Schichten radiatum und lacunosum-moleculare) Vor Immunfärbung gegen die Mikroglia-Marker ionisiertem Calcium-bindenden Adaptermolekül 1 (Iba1 vorab Einbettung) Mikroglia-Zellkörper und Prozesse mit EM zu visualisieren. Die Mäuse werden intraperitoneal Injektion von methoxy-X04-Lösung, 24 Stunden vor der Fixierung durch Hirn transcardial Perfusion gegeben. Koronar Gehirnschnitte werden mit einem Vibratom erhalten. Abschnitte des Hippocampus CA1 enthalten, werden unter einem Fluoreszenzmikroskop auf die Anwesenheit von Aß-Plaques in Schichten radiatum und lacunosum-moleculare gescreent. Immunofärbung für Iba1, Osmiumtetroxid post-Fixierung und Kunststoffharzeinbettung werden dann an den ausgewählten Gehirnschnitten durchgeführt. Am Ende dieses Protokolls können die Abschnitte ohne weitere ultrastrukturelle Abbau archiviert werden, bereit für die Ultradünnschnitt und ultrastrukturelle Untersuchung. Wichtig ist, dass die Plaques noch glimmenden mit verschiedenen Antikörpern nach immunostaining zum Beispiel Iba1 wie im vorliegenden Protokoll. Sie werden dunkler than deren umgebenden Neuropil folgenden Osmiumtetroxid post-Fixierung unabhängig methoxy-X04-Färbung, die die Regionen von Interesse, in der Regel auf wenige Quadratmillimeter genau zu identifizieren hilft, mit dem Transmissions-Elektronenmikroskop untersucht werden. Das Korrelat Ansatz bietet eine effiziente Möglichkeit, spezifische Gehirnschnitte zu identifizieren, die auf der ultrastruktureller Ebene zu untersuchen. Dies ist besonders hilfreich, wenn sie früh AD Pathologie, in spezifischen Hirnregionen oder Schichten zu studieren, die nur wenige Aß-Plaques, die in nur einem kleinen Bruchteil von Gewebeschnitten enthalten. Während dieser Zeiten besonders wäre es ineffizient sein Immunofärbung zu verwenden, um A &amp; bgr; (und Dual Kennzeichnung für andere zelluläre Marker wie Iba1) auf mehreren Hirnschnitten lediglich eine kleine Fraktion, die Aß-Plaques an der richtigen Stelle zu ergeben. Darüber hinaus kann die Injektion von lebenden Mäusen mit Methoxy-X04 vor der Tötung und Gewebeverarbeitung nicht compromise die Ultrastrukturerhaltung. Alternative Methoden wie Post-mortem - Färbung mit Kongo - Rot, Thioflavin S, Thioflavin T oder Methoxy-X04 auf Gewebeschnitten erfordern Färbung Differenzierung in Ethanol, 8-11 , die osmotischen Stress verursacht und stört die Ultrastruktur. Kongo - Rot ist auch ein bekanntes menschliches Karzinogen 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1006">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Methoxy-X04</td>
			<td style="width:197px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">4920</td>
			<td style="width:167px;">10 mg substrate per tablet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene glycol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W294004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-1</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP153500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrolein&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110221</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Granular</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-790-14F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peristaltic Pump with Tubing</td>
			<td>ColeParmer</td>
			<td>cp.78023-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel Winged blood Collection Set Needles 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extrafine Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11152-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hartman Hemostats</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14004-16</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>ROBOZ surgical store</td>
			<td>5818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>74515-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>14047235612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome blades</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>71990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Tissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide, 30%</td>
			<td>J.T.BAKER</td>
			<td>cat: 2186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA), fraction V</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C001H24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti IBA1, Rabbit&#160;</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111066046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.3&#39;-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905-50TAB</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osmium tetroxide, 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44611</td>
			<td>Resin Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44612</td>
			<td>Hardener Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44613</td>
			<td>Plasticizer Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44614</td>
			<td>Accelerator Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>LesAlcoolsdeComerce</td>
			<td>151-01-15N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110205</td>
			<td>Caution: corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum weigh dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70048-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACLAR&#174;&#8211;Fluoropolymer Films</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven/Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light and electron microscopy to study microglial interactions with &#946;-amyloid plaques

Ein detailliertes Protokoll ist vorgesehen, um Amyloid-Aß-Plaques in Hirnschnitten von Alzheimer-Krankheit Mausmodellen vor pre-Einbettungs Immunofärbung (speziell für ionisiertes Calcium bindenden Adaptermolekül 1 (Iba1), einem Calcium-Bindungsprotein exprimiert durch Mikroglia) und Gewebeverarbeitung identifizieren Elektronenmikroskopie (EM). Methoxy-X04 ist ein fluoreszierender Farbstoff, der die Blut-Hirn-Schranke durchquert und bindet selektiv an ß-plissiert gefunden Blätter in dichten Kern Aß-Plaques. Injektion der Tiere mit methoxy-X04 vor der Tötung und Gehirn Fixierung ermöglicht Vorabsiebung und Auswahl der Plaque-enthaltenden Gehirnschnitte für die Weiterverarbeitung mit zeitaufwendige Manipulationen. Dies ist besonders hilfreich, wenn sie früh AD Pathologie in spezifischen Hirnregionen oder Schichten studieren, die nur sehr wenige Plaques enthalten kann, in nur einem kleinen Teil der Abschnitte. Post-mortem-Verarbeitung von Gewebeschnitten mit Kongo-Rot, Thioflavin S und Thioflavin T (oder sogar mit Methoxy-X04) können β-Faltblättern beschriften, erfordert jedoch umfangreiche Clearing mit Ethanol überschüssige Farbe zu entfernen und diese Verfahren sind nicht kompatibel mit ultra Erhaltung. Es wäre auch ineffizient sein Kennzeichnung Aß auszuführen (und andere Zellmarker wie Iba1) auf allen Gehirnschnitte aus den Regionen von Interesse, nur eine kleine Fraktion, die Aß-Plaques an der richtigen Stelle zu ergeben. Wichtig ist, dass Aß-Plaques noch sichtbar nach Gewebeverarbeitung für EM, für eine genaue Identifizierung der Bereiche, so dass (in der Regel bis auf wenige Quadratmillimeter) mit dem Elektronenmikroskop zu untersuchen.

Dieser Abschnitt veranschaulicht die Ergebnisse, die an verschiedenen kritischen Schritte des Protokolls erhalten werden kann. Insbesondere zeigen die Ergebnisse, Beispiele von Gehirnschnitten methoxy-X04 gefärbten Plaques in einem bestimmten Gebiet und Schichten von Interesse enthält: Hippocampus CA1, Schichten radiatum und lacunosum-moleculare. Die Plaques und regionale / Lamellen Organisation des Hippocampus werden mit einer Kombination aus UV- und Hellfeld Filter (Abbildung...

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with ÃŽÂ²-Amyloid Plaques at JoVE.com

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll Amyloid-Aß-Plaques bei Alzheimer-Krankheit Mausmodellen mit methoxy-X04 für die Visualisierung, die die Blut-Hirn-Schranke durchquert und bindet selektiv an ß-plissierten in dichten Kern Aß-Plaques gefunden Blätter. Es ermöglicht Vorabsiebung von Plaque-enthaltenden Gewebeschnitten vor Immunofärbung und Verarbeitung für die Elektronenmikroskopie.

Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Untersuchung Microglial Wechselwirkungen mit β-Amyloid-Plaques

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

correlative-light-electron-microscopy-to-study-microglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Aufrufe.  CHU de Québec Research Center.  Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll Amyloid-Aß-Plaques bei Alzheimer-Krankheit Mausmodellen mit methoxy-X04 für die Visualisierung, die die Blut-Hirn-Schranke durchquert und bindet selektiv an ß-plissierten in dichten Kern Aß-Plaques gefunden Blätter. Es ermöglicht Vorabsiebung von Plaque-enthaltenden Gewebeschnitten vor Immunofärbung und Verarbeitung für die Elektronenmikroskopie. 

Serie: Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Fokussierten Ionenstrahl-Fräs-und Rasterelektronenmikroskopie des Hirngewebes

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Forschung

Neurowissenschaften

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Licht Vorlieben Assay zur angeborenen und Circadian geregelten Photobehavior in Studie<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Lichtinduzierte molekulare Adsorption von Proteinen mit dem PRIMO-System für Mikro-Patterning zur Untersuchung von Zellreaktionen auf extrazelluläre Matrixproteine

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Primärkulturen von Rattenastrozyten und Mikroglia und ihre Verwendung bei der Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) Anwendung zur Bildgebung der Myelinisierung in Gehirnschnitten

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Untersuchung Microglial Wechselwirkungen mit β-Amyloid-Plaques

PLAYLIST