This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].

1. Sperrung Replikation mit FROS <ol><li> Induzierung der Replikation Verstopfungs <ol><li> Verdünnen Sie eine frische über Nacht Kultur eines E. coli Stamm , der ein tetO - Array und PKM1 18 bis OD 600 nm = 0,01 in einer verdünnten komplexen Medium (0,1% Trypton, 0,05% Hefeextrakt, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) mit Antibiotika Durchführung nach Bedarf zur Auswahl. Hinweis: Fügen Sie nicht Tetracyclin zur Auswahl, da es nicht mit diesem System kompatibel ist. Machen das Volumen der Kultur entsprechend 10 ml pro Probe erforderlich. Zum Beispiel ist das Kulturvolumen für die Versuchsplanung in 1 60 ml. </li><li> Wachsen bei 30 ° C unter Schütteln , bis die OD 600 nm = 0,05-0,1. Entfernen Sie eine 10-ml-Probe als nicht-induzierten Kontrolle zu dienen und mit 0,1% Arabinose zu der verbleibenden Kultur die Produktion von TetR-YFP von PKM1 zu induzieren. Weiter wachsen sowohl die nicht-induzierten und veranlaßteKulturen. Nach 1 Stunde überprüfen auf das Vorhandensein eines einzigen Brennpunkt innerhalb jeder Zelle der induzierten Kultur unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie (siehe Abschnitt 2). </li><li> Wenn die induzierten Zellen bestätigt blockiert sind (mehr als 70% der Zellen einen einzigen Fokus), notieren Sie die OD 600nm und nehmen Sie eine 7,5 ml Probe für die Analyse von 2-D - Gelen (siehe Abschnitt 3). Nehmen Sie eine äquivalente Probe von der nicht-induzierten Kontrollkultur. </li></ol></li><li> Durch Loslassen der Replikation Verstopfungs <ol><li> Zum Lösen der Replikation Block, 100 ng ml -1 des unentgeltlichen Induktor Anhydrotetrazyklin (AT) zu einer 10 - ml - Probe der blockierten Zellen. Weiterhin bei 30 ° C für 10 min zu wachsen und Proben für die Zelldichte (1 ml), Mikroskopie-Analyse (10 ul) und neutral neutral 2-dimensional Agarose-Gelen (7,5 ml). </li></ol></li><li> Induzierende Zusammenbruch der replisome <ol><li> Wenn die Zellen ein temperaturempfindliches Allel wie dnaB ts oder dnaC ts enthalten, erfordert deactivation, bewegen Sie den Kolben, die blockierten Zellen auf 42 ° C enthält. Proben für Analyse zu Zeitpunkten erforderlich (beispielsweise 1 Stunde nach Inkubation). Nachdem die Zellen bei 42 ° C für 1 Stunde inkubiert wurden, verschieben sich die Zellen auf 30 ° C für 10 min (siehe Abbildung 1). Anmerkung: Die Zellen können auf 30 ° C für restart Analyse verschoben werden. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig1.jpg" /> Abb . 1: Übersicht über die FROS Replikation blockieren und Freigabe Experimentelles E. coli - Stämme , die tetO - Array tragen , werden bei 30 ° C gezüchtet. Wenn die Zellen eine OD 600nm von über 0,05 zu erreichen, wird TetR-YFP Produktion mit Arabinose induziert (ara; 0,1%). Weiter eine Subpopulation von nicht-induzierten Zellen wachsen zu lassen als Kontrollen bei 30 ° C zu handeln. 2 Stunden (siehe 2.1) - Eine Probe der induzierten Zellen wird nach 1 über Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Wenn die Replikation istbestätigt blockiert werden, werden die Proben für die Reagenzgläser angezeigt 2-D-Gel-Analyse entnommen (siehe 3.1) und für Vitalitätstests (optional). Die Replikations Blockade kann mit Anhydrotetracyclin entfernt werden (AT; 0,1 &amp; mgr; g / ml) und die Zellen 10 min später analysiert. Wenn Zellen ein temperaturempfindliches Allel (zB dnaB ts) tragen, kann dies durch Verschieben der blockierten Zellen auf 42 ° C für eine angemessene Analyse inaktiviert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Bereiten Sie eine Agarose-Pad durch Pipettieren von 500 ul geschmolzene Agarose (1% in Wasser) auf einen Objektträger; Overlay das Deckglas unmittelbar vor den Agarose verfestigt. Lagern Sie den Schieber (s) in feuchten Tüchern bei 4 ° C bis benötigt. </li><li> Wenn die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie das Deckglas aus dem Agarose-Pad und Pipette 10 ul BakterienKultur auf die Mitte des Kissens die Bewegung der Zellen während der Sichtbarmachung zu verhindern. Sobald die Probe (ca. 5 min) getrocknet ist, ersetzen Sie das Deckglas. Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Deckglas und legen Sie die Folie unter der Optik. </li><li> Visualisieren Sie die Zellen unter Verwendung von Phase-Mikroskopie bei 100facher Vergrößerung. <ol><li> Auf der Acquire Dialogfeld innerhalb der Imaging-Software, stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 ms. Nehmen Sie das Bild von Acquire auswählen. Sie nicht auf die Bühne zu bewegen. Im Dialogfenster Acquire, wählen Sie YFP als Beleuchtung für den Außen Shutter-Kamera verbunden ist. Stellen Sie die exporsure Zeit bis 1000 ms. Schalten Sie das Bühnenlicht. Nehmen Sie das Fluoreszenzbild von Acquire auswählen. Hinweis: Zeit kann je nach Lichtquelle, Mikroskop und verwendeten Kamera. </li><li> Um die Phase und fluoreszierenden Bildern überlagern, wählen Sie Farbe aus dem Display-Menü zu kombinieren. Im Farb Kombinieren Dialogfeld wählen Sie das YFP Bild als grüne Komponente und dem Phasenbild als blue Komponente. Klicken Sie auf Farbe kombinieren. Bestimmen Sie, ob die Bevölkerung hatte die Replikation erfolgreich blockiert durch die Festlegung, ob die Mehrheit der Zellen pro Zelle ein Fokus haben. Anmerkung: Vergleich zu einer Probe von der Steuerung ohne Zusatz von Arabinose nützlich ist, um visuell den Unterschied in eYFP Produktion zu identifizieren. </li></ol></li></ol> 3. DNA-Extraktion / Agarose-Stecker <ol><li> Hinzufügen Natriumazid (Endkonzentration von 0,1%) zu den 7,5 ml Kulturproben aus den Schritten 1.1.3 und 1.2.1. Inkubieren auf Eis für mindestens 5 min. Hinweis: Natriumazid extrem giftig ist. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblatt vor Beginn der Arbeit und gehe es erst, wenn alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen 5000 × g für 10 min Zellen zu pelletieren. Überstand verwerfen und das Pellet in 200 ul Pett IV (PIV) -Puffer (10 mM Tris: HCl (pH 8,0), 1 M NaCl). Mikrozentrifuge (13 000 × g für 2 min) Zellen zu pelletieren. DiSCARD den Überstand. In diesem Stadium des Verfahrens die Pellets weiter oder bei -20 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen mit der niedrigsten Zelldichte in 50 ul PIV und bei 50 ° C. Bei allen anderen Proben, die Volumina der PIV einzustellen, die endgültige Zelldichte die gleiche in jedem Röhrchen (zB Probe 1 (OD 600nm = 0.128) in 50 &amp; mgr; l resuspendiert, Probe 2 (OD 600 nm = 0,138) resuspendiert in 54 &amp; mgr; l). <ol><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen von frisch hergestellten 0,8% igen Lösung in PIV (Endkonzentration 0,4%; , z. B. Probe 1 50 ul Probe 2 54 ul). Stellen Sie sicher, dass die Proben, Agarose und PIV über 50 ° C sind Erstarrung zu verhindern. </li></ol></li><li> Behandeln eines Mikroskop-Objektträger mit 40 ul einer geeigneten Glas Wasser abweisend oder Silikonlösung. Reiben Sie die Folie mit einem Gewebe, bis es trocken ist. Hinweis: Dies kann im Voraus und die behandelten Folien gespeichert langfristig bei Raumtemperatur durchgeführt werden. </li><li> Legen Sie 20 ul Tropfen ter Zelle / Agarosesuspension auf der Folie Stecker zu produzieren, die halbkugeligen sind. Hinweis: Die erste Probe (resuspendiert in 50 &amp; mgr; l PIV) 5 Stecker auf einer Folie erzeugt. </li><li> Wenn die Pfropfen verfestigt haben, schieben sie sanft in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zugabe von 1 ml Zell-Lyse-Puffer (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M NaCl, 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,2% Natriumdesoxycholat, 0,5% N-Lauroylsarcosin - Natriumsalz (Sarkosyl), 100 ug ml - 1 Lysozym, 50 ug ml - 1 RNase A). Inkubieren bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die Zell - Lyse - Puffer und 1 ml EDTA / Sarkosyl / Proteinase K (ESP) -Lösung (0,5 M EDTA, 1% N-Lauroylsarcosin - Natriumsalz (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 Proteinase K). bei 50 ° C inkubieren sind über Nacht oder bis die Stecker transparent. Wenn eine zweite Inkubation über Nacht erforderlich ist, ersetzen Sie die ESP-Lösung mit frischem Puffer nach etwa 18 Stunden. </li><li> Entferne dasESP-Puffer und die Stecker 5 mal mit 12 ml Tris-EDTA (TE) -Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) waschen 30 min Äquilibrierung mit jeder Wäsche ermöglicht. Lagerung bei 4 ° C in 1 ml TE-Puffer. </li></ol> 4. Neutral-neutral 2-dimensionale Gelelektrophorese <ol><li> Übertragen Sie eine Agarose-Stecker aus Schritt 3.8 in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 150 ul Restriktionsenzym-Puffer (1x Konzentration). 25-100 Einheiten Restriktionsenzym (beispielsweise 60 Einheiten EcoRV; (siehe 3A)). Digest bei 37 ° C für 6-8 Stunden. </li><li> Bei 4 ° C, gießen Sie ein 0,4% Agarose-Gel (300 ml) in 1x Tris / Borat / EDTA (TBE) in einen Gelträger von ca. 25 x 25 cm. etwa die gleiche Breite wie der Durchmesser des Steckers Setzen Sie einen Kamm Brunnen zu machen. Wenn das Gel gesetzt ist, nehmen Sie den Kamm und das Gel auf Raumtemperatur bewegen. </li><li> Schieben Sie eine der verdauten Agarose-Stecker in einen Brunnen, die Positionierung des Flachschiebers des Steckers gegen die Seite des Bohrlochs, wobei ter DNA wird in das Gel eintreten. Legen Sie einen einzelnen Stecker auf die gleiche Weise in jeder Sekunde gut. </li><li> Pipettieren geschmolzene 0,4% Agarose in die Vertiefungen der Stecker in Position zu versiegeln. </li><li> Last 1 kb DNA-Leiter in einem leeren gut, so dass wieder eine Lücke zwischen dem Leiter und Proben, und über Nacht laufen, das Gel (16 h, 55 V) in 1x TBE bei Raumtemperatur. </li><li> Beflecken das Gel in einem Wasserbad enthaltend Ethidiumbromid (0,3 &amp; mgr; g ml -1) für 20 min. Hinweis: Ethidiumbromid ein potenter mutagen und ein Toxin betrachtet wird. Lesen Sie die Sicherheitsdatenblatt vor Beginn der Arbeit und gehe es erst, wenn alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen. </li><li> Visualisieren Sie die DNA mit einem UV-Transilluminator langwellige und schneiden Sie jede Spur Fragment mit einer geraden, auch geschnitten, die Aufnahme von überschüssigem Agarose auf beiden Seiten der Bahn zu minimieren. Hinweis: Wenn beispielsweise das Fragment von Interesse 5,5 kb ist, geschnitten, um ein 7,5 cm-Fragment der DNA-Fragmente von 5 kb, umfassen approximately 12 kb (siehe 3A). </li><li> Legen Sie die ausgeschnittenen Gel Spur in einem Gelträger 90 ° zur Richtung der DNA-Migration. Hinweis: Zwei Reihen von 3 Gelfragmenten in einem 25 x 25 cm 2 Geltablett passen. Die erste Reihe von Gelspuren ist an der Spitze der Schale, die zweite Reihe bei 12,5 cm. </li><li> Bereiten Sie 300 ml Agarose für die zweite Dimension Gel (0,9% in 1x TBE mit 0,3 ug ml -1 Ethidiumbromid). Wenn der Agarose auf 50 ° C abgekühlt wird, das geschmolzene Agarose pipettieren um die Gelscheiben ihre Position zu verfestigen. Gießen Sie die restliche Agarose in die Schale bis zu einer Tiefe, die zumindest in Höhe der Gelschnitten ist. </li><li> Sobald das Gel erstarrt ist, Elektrophorese bei 4 ° C in TBE 1x , enthaltend 0,3 &amp; mgr; g ml -1 Ethidiumbromid bei 220 V , bis die DNA etwa 10 cm gewandert ist. Hinweis: 4 Stunden für ein 5,5-kb-Fragment ausreichend ist, aber ein kleineres Fragment wird weniger Zeit benötigen. </li><li> Excise die Blöcke, wo die genomische DNA vorhanden ist usingen den Rand eines Metalllineal, einschließlich dem Gel darüber die DNA enthalten , die nicht sichtbar sind (siehe Abbildung 3c). </li></ol> 5. Southern-Hybridisierung <ol><li> Herstellung der Lösung <ol><li> Bereiten Sie Depurinierung Puffer (0,125 M HCl-Lösung). Anmerkung: Dieser Puffer wieder verwendet werden kann und ist stabil bei Raumtemperatur für bis zu 1 Monat. </li><li> Bereiten Sie Denaturierungspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH). Anmerkung: Denaturierungspuffer wiederverwendet werden kann, sobald und stabil für bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Neutralisationspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Passen Sie auf pH 7,5 mit HCl. Anmerkung: Neutralisationspuffer einmal wiederverwendet werden kann und stabil für bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten 10x Saline Sodium Citrate (SSC) Puffer (0,15 M Tri-Natriumcitrat, 1,5 M NaCl, pH-Wert 7 - 8) für die Verwendung in den Schritten 5.2.4 und 5.2.6. Von diesem Puffer, einen 2 × SSC Lager machen (für den Einsatz in Schritt 5.2.9). Hinweis: 10x SSC und 2x SSC einwieder stabil bei RT für 3 Monate. </li><li> Bereiten Modifizierte Church und Gilbert Hybridisierungspuffer 19 (0,5 M Phosphatpuffer [pH 7,2], 7% (w / v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 10 mM EDTA). Lassen bei 65 ° C gründlich vor auflösen zu verwenden. </li></ol></li><li> Übertragung <ol><li> Spülen Sie die ausgeschnittenen Gelblöcken in Depurination Lösung für 10 min bei RT auf einer Wippe oder Orbitalschüttler. Halten Sie die Bewegungsgeschwindigkeit niedrig zu vermeiden, die Agarose-Blöcke zu beschädigen. </li><li> Spülen Sie die Gelblöcken kurz mit destilliertem Wasser und dann mit einer Denaturierung Puffer für 30 min. Spülen Sie nochmals kurz in destilliertem Wasser und dann brüten die Gelblöcken in Neutralisierungspuffer für 30 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Schneiden Sie eine Nylonmembran auf die genaue Größe des Gels (s). Schneiden Sie ein Nick in der oberen rechten Ecke bei der Ausrichtung der Membran in Zukunft Schritte zu unterstützen. Anmerkung: Zwei Gelblöcke (6 Proben) auf eine Membran sichtbar gemacht werden. </li><li> Gießen Sie genug 10x SSC in eine tray, so daß sie nicht über Nacht trocknen. Eine Plattform ca. 5 cm über dem Niveau des Puffers. Sättigen 3 Blatt 3 MM-Chromatographie-Papier mit 10x SSC und Platz auf der Plattform. Schneiden Sie die Chromatographie Papier so, dass es lang genug ist, an beiden Enden und breit genug, um in Puffer eingetaucht werden, um die Membran Gel zu passen. </li><li> Legen Sie das Gel (n) auf der Oberseite des gesättigten Chromatographie-Papier. Rahmen Sie das Gel mit Plastikfolie den Puffer unter Umgehung des Gels während der Übertragung zu verhindern. Vorsichtig legen die Schnitt Membran auf der Oberseite des Gels (s). Entfernen Sie Luftblasen zwischen der Membran und Gel durch eine Flasche oder serologische Pipette vorsichtig über die Membran rollen. </li><li> Schneiden drei Blatt 3MM Chromatographiepapier auf die gleiche Größe wie die Membran. Tränken Sie die Chromatographie Papierblätter mit 10x SSC und legen auf der Oberseite der Membran. Entfernen Sie alle Luftblasen, die sich gebildet haben. </li><li> Stapel Papiertücher mindestens 5 cm hoch oben auf dem Löschpapier, gefolgt von einem festen Träger (approximate Gewicht von 1 kg für einen 23 x 16 cm-Membran). Lassen Sie den Transfer über Nacht ablaufen. </li><li> Belichten der Membran (DNA Seite nach oben) zu 1,200 J / m 2 UV die DNA an der Membran zu vernetzen. Sie nicht zu diesem Schritt vor spülen. </li><li> Spülen Sie die Membran gründlich in 2 × SSC zu hohen Hintergrund auf dem Blot Bilder verhindern. Verwenden Sie den Fleck sofort für die Hybridisierung (siehe 5.3) oder bei RT trocknen, wickeln Sie in der Plastikverpackung und lagern bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Hybridisation <ol><li> Vorheiz Hybridisierungsofen und Flaschen auf 55 ° C. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; g ml -1 Rinderserumalbumin (BSA) und 10 &amp; mgr; g ml -1 unspezifische DNA (beispielsweise Lachssperma - DNA) mit dem vorgewärmten Hybridisierungspuffer. </li><li> Um eine gleichmäßige Abdeckung des Hybridisierungspuffers ermöglichen, wenn die Membran aufgerollt wird, legen Sie den Fleck auf einen ähnlich großen Quadrat aus Nylon mit der DNA-gebundenen Seite der Membran Netz nach oben zeigt. Rollen Sie den Fleck entlang seiner langen Kante. Gleitender Blot / innen einer Hybridisierungsflasche ineinander greifen. Füge eine geeignete Menge vorgewärmten Hybridisierungspuffer des Blots (zB 30 ml für ein 23 x 16 cm 2 Membran) zu entrollen. </li><li> Inkubieren in einem vorgeheizten Ofen, um die Flaschen zu drehen, für 1 Stunde. </li><li> Bereiten Sie die Sonde durch 50 ng gereinigte PCR - Produkt homolog zu der Region von Interesse Mischen, 150 ng von zufälligen Hexamer - Primern, Puffer für Klenow - Fragment und H 2 O mit einem Volumen von 13 &amp; mgr; l zu machen. Kochen für 3 Minuten dann sofort auf Eis legen. 1 ul 1 mM dCTP / dGTP / dTTP - Mix, 1 ul Klenow - Fragment (5U) und 50 uCi Desoxyadenosin - 5&#39;-triphosphat radiomarkierten am alpha phosphat- (α 32 P-dATP). </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. 1 ul 1 mM dNTP mischen und 1 ul Klenow-Fragment. Inkubiere 20 min bei RT. </li><li> Boil-Sonde für 5 Minuten und fügen Sie sofort auf Hybridisierungsröhrchen. Hybridisierung über Nacht bei 55 ° C, mit einer Drehung. </li><li> Umfüllen probe von Membran. Anmerkung: Die Sonde der Lage ist, einmal wiederverwendet zu werden. </li><li> Spülen Sie die Membran kurz in vorgewärmten, niedriger Stringenz-Waschpuffer (2x SSC, 0,1% (w / v) SDS). In frischen niedriger Stringenz-Waschpuffer und Inkubation für 5 min bei 55 ° C mit Rotation. Wiederholen. </li><li> Zweimal waschen in mittlerer Stringenz-Waschpuffer (1x SSC, 0,1% (w / v) SDS) für 10 min bei 55 ° C mit Rotation. </li><li> Zweimal waschen in hoher Stringenz-Waschpuffer (0,1X SSC, 0,1% (w / v) SDS) für 5 min bei 55 ° C mit Rotation. </li><li> Entfernen Sie die Membran und tupfen mit Gewebe überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Wickeln in Plastikfolie sicherzustellen gibt es keine verbleibende Feuchtigkeit auf der Plastikfolie und in Belichtungskassette mit einer vorgeblendeten Speicherleuchtstofffolie. Schließen Sie die Kassette und setzen mindestens 2 Stunden vor der Visualisierung für eine Phosphor-Imager verwendet wird. </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+with+temperature-sensitive+synthesis+of+DNA.">Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA.</a> Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).</li><li>Nawotka, K. A., Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoretic+method+for+mapping+DNA+replicons.">Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons.</a> Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).</li><li>Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+psoralen+interstrand+cross-links+from+DNA+of+Escherichia+coli:+mechanism+and+genetic+control.">Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control.</a> J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most common impediment to replisomes in living cells is a nucleoprotein block2. However, two longstanding difficulties in studying the collision of a replisome with a nucleoprotein blockage have been how to localize the event to a known position on the chromosome and how to make the event frequent enough to allow detailed analysis. The majority of the knowledge of how E. coli copes with stalled/collapsed replication forks comes from the use of UV as a DNA damaging agent. 
The FROS protocol described here is a novel way of creating a site-specific nucleoprotein roadblock, similar to what the replisome will meet when it encounters proteins tightly bound to the chromosome during replication. The induced blockage and controlled release of this block allows the stages of DNA processing to be studied in discrete steps. The array of tetO sites used to block replication has previously been utilized to visualize chromosome organization9,10. While the array can be placed anywhere in the chromosome, for the purpose of the array described here, it should be distant from both the origin and the terminus to avoid complications in interpreting the signals observed from second rounds of initiation at the origin or from the replication fork proceeding around the opposite replichore. By optimizing the overproduction of TetR with the use of the dilute complex medium (protocol 1), we have found that sufficient TetR is produced to create a complete replication blockage that is stably maintained, while limiting the number of new rounds of replication that are initiated. The incorporation of replisome temperature sensitive mutations22 into the system ensures all replisomes are deactivated simultaneously and uncontrolled replisome reloading is prevented.
Whilst the number of foci per cell are useful for knowing the cell's replication status, the most enlightening data for DNA repair is from the analysis of the replication intermediates revealed by 2-D gel electrophoresis during an active replication blockage. Analysis of different genetic backgrounds can identify proteins involved in processing and restart of collapsed replication forks by the different patterns observed following the 2-D gel protocol. Further, intermediates from the processing of collapsed replication forks can be present at the array region or in the DNA upstream of the array, and can be visualized using 2-D gel electrophoresis. Creating duplicate agarose plugs (Protocol 3) has the advantage of allowing for digestion of the same sample with different restriction enzymes to be able to visualize replication intermediates in successive DNA regions. Therefore, the array region should be located in a position where appropriate restriction enzymes can be used to probe these regions of interest using Southern hybridization. 
The most common reasons that this technique may be unsuccessful are having either too little DNA which produces faint signals compared to background, or incomplete digestion of the DNA within the plugs. This can be caused by having too much DNA in the agarose plugs or the carry-over of some inhibitor from the lysis/washing steps. The number of cells taken for lysis within the agarose plugs may need to be varied from the protocol described here if modifications such as growth media are changed. However, it is futile to continue with the hybridization if the DNA in the plugs has not digested to completion. A repeat treatment of ESP may be required to better prepare the DNA (protocol 3.6). 
If the replication intermediates that are of interest are only transient, or are particularly rare within the cell, the DNA sample may need to be enriched for them, for example with the use of BND-cellulose which will bind short stretches of single stranded DNA, such as those found in replicating chromosomes23. Stabilization of replication intermediates by crosslinking with psoralen has also been used as a method of preserving DNA integrity24. When the intermediates are rare, it is important to optimize the probe and blocking of the membrane to prevent background signals from interfering. On completion of the blots the signals may be quantified with appropriate image processing software.
The protocol described here is an optimized system for creating a site-specific nucleoprotein blockage and analyzing replication intermediates when the replisome is unable to proceed through the blockage. With the establishment and optimization of this technique, the roles of various helicases and recombination proteins in processing the replication fork and in allowing the restart of replication can be identified. By varying the genetic background, the effect of the absence of these proteins can be analyzed. However, this technique is limited by requiring not only viable strains but strains that are also able to overproduce TetR at a rate that will create a stable nucleoprotein blockage.

Während der DNA-Replikation, steht die replisome Hindernisse auf der DNA, die ihr Fortschreiten beeinträchtigen. DNA - Schäden , einschließlich Läsionen und Lücken sowie anomale Strukturen können die replisome , fortzusetzen 1 zu verhindern. Vor kurzem wurde gefunden , dass an die DNA gebundenen Proteine ​​die häufigste Quelle für Hindernis sind 2 fork Progression Replikation. Das Wissen über die Ereignisse im Anschluss an die Begegnung der replisome mit einem Nukleoprotein Block an einem bekannten Ort durch die Unfähigkeit beschränkt zu induzieren einen solchen Block in das Chromosom einer lebenden Zelle vorher. In - vitro - Analyse unser Verständnis der kinetischen Verhalten wurde verbessert einer aktiven replisome , wenn es eine Verstopfung Nukleoprotein 3, sowie die mechanistischen Details der replisome selbst 4,5 erfüllt. Das aktuelle Verständnis der Reparatur der Replikation wird in der Regel mit UV als schädigende Mittel vorgenommen und untersucht in vivo unter Verwendung von Plasmid - DNA 6-8 </sup&gt;. Während die Proteine ​​, die in der Reparatur von DNA beteiligt sein können , nachdem er eine in vivo - Nukleoprotein Block begegnet werden in der Regel aus diesen Studien verstanden, ob es Unterschiede in den molekularen Vorgänge innerhalb der Reparaturwege aufgrund der deutlichen Ursache in der Replikationsblock sind noch noch ist bestimmt werden. Hier beschreiben wir ein System, das ein Nukleoprotein Block ermöglicht in einer bestimmten Stelle des Chromosoms hergestellt werden unter Verwendung eines Fluoreszenz-Repressor Operator System (FROS). Wir verwenden einen Stamm von E. coli , das ein Array von 240 tetO - Stellen in das Chromosom eingebaut 9 hatte. Jede tetO - Stelle innerhalb des Arrays hat eine 10 bp Zufallssequenz flankieren sie die Stabilität der Anordnung zu erhöhen durch RecA-vermittelte Rekombination innerhalb des Arrays zu verhindern. Dieses Array, und Variationen davon, wurden ursprünglich verwendet , um E. verstehen coli Chromosom Dynamik 10,11 aber wurden dann preve angepaßtnt in vivo - Replikation 12. Das Array wurde gefunden, stabil aufrechterhalten werden und nahezu 100% der Replikationsgabeln zu blockieren , wenn sie von TetR 10,12 gebunden. Die Verwendung des ähnlichen lacO Array in vitro hat , so wenig wie 22 gefunden Seiten ausreichend waren 90% der Replikation zu blockieren, obwohl dies kürzere Anordnung weniger effektiv war in vivo 13. Um das Array anzupassen eine Nukleoprotein Blockade zu schaffen, muss das Repressor-Protein hoch werden unter optimierten Bedingungen überproduzierte wo es dann an das Array bindet eine Straßensperre zu schaffen. Die Bildung der Blockade, und seine anschließende Freisetzung können durch die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden, wenn ein fluoreszierend markiert Variante des Tet-Repressor verwendet wird. Der Status der Replikation in jeder Zelle wird durch die Anzahl der Foci gesehen angedeutet, wo ein einzelner Brennpunkt bedeutet nur eine Kopie des Arrays innerhalb der Zelle vorhanden ist und mehrere Brennpunkte sind kennzeichnend für aktive Replikation. Diese aktive Wiederdung wird aktiviert, wenn das Nukleoprotein Blockierung durch die Zugabe des gratuitous Induktor umgekehrt wird, die die Bindungsaffinität von TetR für die Operatorstelle abnimmt ausreichend für die replisome durch das Array fortzufahren. Das Repressor-Protein ist noch in der Lage mit einer ausreichend hohen Affinität an die DNA zu binden, die nun mehrere Kopien der Array sichtbar gemacht werden kann. Weitere komplizierten Details der Ereignisse können an der Nukleoprotein Blockade 14-16 mit neutral-neutral zweidimensionalen Agarose - Gelelektrophorese und Southern - Hybridisierung werden entdeckt. Diese Techniken erlauben die Analyse von DNA-Strukturen in der Bevölkerung. Die Replikationszwischenprodukte, die während des Ereignisses gebildet sind und bleiben potentiell unrepaired können visualisiert werden. Durch Variation der Restriktionsenzym und die Sonde verwendet wird , können die Zwischenprodukte dargestellt werden , nicht nur in dem Feldbereich , sondern auch stromaufwärts des Arrays , wenn der Replikationsgabel 17,18 zurückbildet. DasRegression nimmt an den replisome Dissoziation nachfolgenden platzieren; die führenden und hinken im Entstehen begriffenen Stränge getrennt von den Template-Stränge und Ausheilen miteinander, wie die Template-Stränge gleichzeitig erneut Glühen in einer DNA-Struktur Vier-Wege resultierende (a Holliday). Unter Verwendung dieses Systems hat sich gezeigt , dass der Replikationsgabel nicht stabil ist , wenn es diesen Block 18 stößt. Darüber hinaus können Derivate von replisome Komponenten empfindlichen Temperatur Neuladen der Replikationsgabel zu verhindern, verwendet werden, wenn es zusammengebrochen ist. Sobald ein Block hergestellt wird, kann die Belastung auf eine nicht-permissive Temperatur verschoben werden, um ein synchrones Abschalten der replisome und eine kontrollierte Prävention Nachladen zu gewährleisten. Diese temperaturbedingten Deaktivierung gewährleistet alle der Gabeln in der Bevölkerung zu einer gegebenen Zeit zusammengebrochen sind und ermöglicht die Bewertung dessen, was geschieht, wenn der replisome kollabiert, wie die DNA verarbeitet wird, und dem, was erforderlich ist, um wiederden Prozess der DNA-Replikation starten. Ein Vorteil der hier beschriebenen System ist, dass das Nukleoprotein Block vollständig reversibel ist; Daher wurde die Fähigkeit der Zellen aus dem Nukleoprotein Block wiederherzustellen der Lage ist, zu folgen. Die Zugabe von Anhydrotetrazyklin zu den Zellen wird die enge Bindung des Repressor entlasten, so dass eine Replikationsgabel zu gehen durch und die Lebensfähigkeit der Zellen wieder zu erlangen. Das Relief der Blockade kann durch neutrale neutralen zweidimensionalen Agarose-Gelelektrophorese nach 5 min, und durch Mikroskopie innerhalb von 10 min sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus kann die Lebensfähigkeit Analyse die Fähigkeit des Stammes offenbaren aus der Replikations Blockade zu erholen und weiter zu vermehren. Durch Veränderung des genetischen Hintergründe der in dem experimentellen Verfahren verwendeten Stämme hier beschrieben, können die Reparaturwege für diese Art von Blockierung erläutert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16922</td>
			<td>Growth media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>Growth media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92144</td>
			<td>Growth media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Growth media component; Potassium buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>Growth media component; Potassium buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>For induction of TetR-YFP production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37919</td>
			<td>Release of replication bloackage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioskop 2 Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>452310</td>
			<td>Visualization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eYFP filter set</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>41028</td>
			<td>Visualization of YFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca-AG</td>
			<td>Visualization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160; Software (Molecular Devices)</td>
			<td>SDR Scientific</td>
			<td>31282</td>
			<td>Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td>For agarose plugs and gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Glass Water Repellent (Rain-X)</td>
			<td>Autobarn</td>
			<td>DIO1470</td>
			<td>For agarose plug manufacture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC103157P</td>
			<td>TE, TBE buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diaminetetraacetic acid</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA180</td>
			<td>0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Bacteriostatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>TE buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Cell lysis buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5125</td>
			<td>Cell lysis and ESP buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>Cell lysis buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>6300</td>
			<td>Cell lysis buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>AM0706</td>
			<td>ESP buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell Model 192 Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704507</td>
			<td>Electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator 2000</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708110</td>
			<td>Visualization of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610433</td>
			<td>Visualization of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PROL20185.360</td>
			<td>TBE component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-XL nylon memrbane</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN203S</td>
			<td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3MM Whatman chromatography paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>3030690</td>
			<td>Southern blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-2000 Hybrilinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0031-01/02</td>
			<td>Crosslinking of DNA and hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from salmon sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31149</td>
			<td>Hybridization buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Denaturation buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PROL27833.363</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>227</td>
			<td>Wash buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Hybridization buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primers</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow fragment</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate-32P-ATP</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>BLU502A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage Phosphor Screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GEHE28-9564-76</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9558-09</td>
			<td>Visualization of blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization bottle</td>
			<td>UVP</td>
			<td>07-0194-02</td>
			<td>35 x 300mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system

Hindernisse, die auf DNA, einschließlich fest gebundene Proteine ​​und verschiedene Läsionen, kann das Fortschreiten der Zelle Replikationsmaschinerie stark hemmen. Das Abwürgen eines replisome kann aus dem Chromosom zu seiner Dissoziation führen, entweder teilweise oder vollständig, um den Zusammenbruch der Replikationsgabel führt. Die Erholung von diesem Zusammenbruch ist eine Notwendigkeit für die Zelle genau vollständige Chromosomen Vervielfältigung und anschließend unterteilen. Daher wird, wenn der Zusammenbruch auftritt, hat die Zelle verschiedene Mechanismen entwickelt, die stattfinden, um die DNA Gabel und erlauben die Replikation wiederherzustellen mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden. Zuvor wurden diese Replikationsreparaturwege in Bakterien unter Verwendung von UV-Schäden untersucht, was den Nachteil hat, nicht auf einen bekannten Ort lokalisiert ist. Dieses Manuskript beschreibt ein System mit einem Fluoreszenz-Repressor Operator System (FROS) unter Verwendung eines ortsspezifischen Protein Block zu erstellen, die ein Abwürgen und Zusammenbruch der Replikation induzieren kann foRKS in Escherichia coli. Protokolle Detail, wie der Status der Replikation kann in einzelnen lebenden Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und DNA-Replikationszwischenprodukte dargestellt werden kann durch 2-dimensionale Agarose-Gelelektrophorese analysiert werden. Temperaturempfindlichen Mutanten von replisome Komponenten (zB DnaBts) können in das System eingebaut werden , um einen synchronen Kollabieren der Replikationsgabeln zu induzieren. Ferner sind die Rollen der Rekombinationsproteine ​​und Helikasen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, können unter Verwendung von genetischen Vorprägungen in diesem System untersucht werden.

Die FROS ein induzierbarer, ortsspezifische Nukleoprotein Block, der Replikationszwischenprodukte ermöglicht 12,18 in lebenden Zellen visualisiert werden. Eine allgemeine experimentelle Design für Zellen Abtasten ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Zeitpunkt der Probenahme und Variationen in der genetischen Hintergrund dieses machen ein vielseitiges System für die Reparatur eines solchen Blocks zu studieren. Die schematische veranschaulicht , wie temperaturempfindlichen Mutanten, wie dnaB ts und dnaC ts , die in diesem System bisher 18, verwendet werden kann , verwendet wurden. Die Induktion der FROS wurde in einem E. durchgeführt coli - Stamm , wie in Figur 1 gezeigt für nicht-temperaturempfindliche Stämme. Um zu bestätigen, dass ein Nukleoprotein Block wurde bereits festgelegt wurden die Zellen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie nach 1 Stunde von Wachstum in 0,1% Arabinose sichtbar gemacht. DiesZeitraum ist in der Regel ausreichend, um den Block in einem Wildtyp-Stamm zu produzieren, aber anspruchsvoller Stämme können Optimierung erfordern. Die Mehrzahl der Zellen enthalten 1 Fokus (2A + ara), innerhalb der Zelle nur eine Kopie des Arrays entspricht , wodurch die Replikation anzeigt , blockiert worden waren. Die Zahl der Zellen mit 1 Fokus, 2 Herde oder mehr als 2 Foci wurden in einer Bevölkerung von mehr als 100 Zellen gezählt. 92% der Zellen wurden Fokus haben 1 mit dem restlichen 8% mit 2 Herde gefunden. Es wurde angenommen, dass Zellen, die zwei Brennpunkte weit voneinander beabstandet waren, die zwei Kopien des Arrays würden blockiert die nächste Runde der Replikation haben. Zellen, die mit zwei Brennpunkten bedeuten nahe beieinander, dass das Array vor kurzem repliziert wurde und das Nukleoprotein Block noch nicht erreicht hat. Der Nukleoprotein Block wurde durch Zugabe von Anhydrotetracyclin (AT) und nachfolgende Vervielfältigung des Arrays wie die visualisierten umgekehrtAnreicherung von Zellen mit mehreren Brennpunkten (2A + ara / AT). Mehrere Brennpunkte innerhalb einer Zelle durch Fluoreszenz sichtbar gemacht Mikrokopie des Arrays bedeuten wurde erfolgreich repliziert und genügend Zeit vergangen ist die Orte zu ermöglichen auseinander zu bewegen, jede Schwester-Chromosom Zusammenhalt zu überwinden, die vorhanden war. In diesem Fall 10 Minuten nach der Zugabe von AT, 94% der Zellen wiesen zwei oder mehr Brennpunkte und bis zu 8 Foci pro Zelle sichtbar gemacht wurden. Um sicherzustellen , dass das Nukleoprotein Block tatsächlich Replikation hemmte, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen untersucht (Figur 2B). Zellen, die von den FROS inhibiert die Replikation hatten zeigen eine etwa 1000fache Abnahme der koloniebildenden Einheiten im Vergleich zu den Zellen bilden, die nicht in Gegenwart von Arabinose gezüchtet wurden. Zellen, die wurden anschließend in Gegenwart von Anhydrotetrazyklin zeigen Umkehrung dieses Wachstumshemmung gewachsen. Wenn die Zellen nicht in der Lage waren, die DNA nach der Freigabe zur Reparaturder Nukleoprotein Blockade würde eine Verringerung der Lebensfähigkeit. Zur Visualisierung können die Replikationszwischenprodukte, Zellen in Agarose-Stopfen lysiert werden und das Protein und RNA entfernt. Die DNA kann dann mit einem geeigneten Restriktionsenzym für die interessierende Region verdaut werden. DNA dargestellt in 3A wurde mit EcoRV verdaut , die die DNA unmittelbar vor der Anordnung schneidet, innerhalb der Anordnung und nach dem Array 5,5 kb und 6,7 kb Fragmente in dem interessierenden Bereich (3B) zu ergeben. Die Fragmente sind ideal ~ 3-7 kb für das Protokoll hier beschrieben. Fragmente außerhalb dieses Bereichs können eine Veränderung der Agarose-Konzentrationen verwendet, und die Elektrophorese-Bedingungen erfordern eine gute Trennung zu erzielen. Die DNA wurde in der ersten Dimension und visualisiert (3A) elektrophoresiert. Wenn die DNA vollständig verdaut hat, haben alle Bahnen laufen gleichmäßig, und es wirdeine hohe Menge an niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 3 kb, auf dem Restriktionsenzym abhängig). DNA, die in der gut schlägt vor, unvollständige Zell-Lyse und eine Menge hochmolekulare DNA (über 10 kb) impliziert unvollständige DNA-Verdauung. Die DNA von Interesse in jeder Spur herausgeschnitten wurde. In 3A wurde DNA über 5 kb enthalten. Die anschließende zweite Dimension des Gels wurde elektrophoresiert, was zu einer Diagonale von linearen DNA (3C). Die Array - DNA innerhalb dieses Gel wurde dann durch Southern - Hybridisierung (Figur 3D) sichtbar gemacht . In der unblockierten (- ara sample), zwei Flecken können entsprechend den 5,5 kb und 6,7 kb Fragmente der Anordnung zu sehen ist, werden, wie erwartet. Die Probe, die die Replikation (+ ara) blockiert waren, zeigten eine Abnahme der 5,5 kb Stelle im Vergleich und die Zugabe eines elliptischen Signal, eine Anhäufung von Y-förmigen DNA in der Probe anzeigt. Das Signal istlokalisiert auf eine Position, was bedeutet, die Replikationsgabeln in der Bevölkerung in einer ähnlichen Stelle verhaften. Bei Zugabe von anhydrotetracyline kann das Y-förmige DNA-Signal nicht mehr gesehen werden. Eine kürzlich Neustart wird durch das Vorhandensein eines Signals des gesamten Y-arc angegeben, darstellend die Gabeln durch die Region migrieren. Es ist wichtig, die DNA innerhalb jedes Agarose Stecker zu normieren die Signale der Proben selbst zu gewährleisten. Die Signale können mit entsprechenden Imaging-Software quantifiziert werden. Ein weiteres gemeinsames Zwischen gesehen ist, dass anzeigt, Holliday (HJ) Bildung. A HJ als Kegel - Signal an der Oberseite des Y-Lichtbogens und einer Spitze von der linearen DNA am Ende des Y arc (Abbildung 3D) sichtbar gemacht . <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig2.jpg" /> Abbildung 2: Fluoreszenzmikroskopie und Viab<html> ility. (A) Ein E. coli Stamm , der die tetO - Array trägt , wurde bei 30 ° C in Gegenwart von 0,1% Arabinose (+ ara) für 1 h gezüchtet und dann Anhydrotetracyclin (AT) wurde für 10 min auf eine Subpopulation hinzugefügt , um den Replikationsblock freizugeben. Repräsentative mikroskopische Aufnahmen sind für YFP Produktion (oben) gezeigt. Maßstabsbalken = 2 &amp; mgr; m. Der Anteil der Zellen, die 1, 2 oder mehr als 2 Foci wurden aufgezählt und sind als Prozentsatz (unten) dargestellt. (B) Zellen in Abwesenheit von Arabinose gezüchtet (- ara) mit Arabinose (+ ara) und beide mit Arabinose und Anhydrotetracyclin (AT; 10 min) wurden seriell verdünntem 10fache und entweder spotted oder verteilt auf Agar Ampicillin nur die ( - / + ara Proben) oder Ampicillin mit Anhydrotetracyclin (+ aT Probe) und bei 30 ° C gezüchtet die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Oben: repräsentative Platte zum angegebenen Verdünnungen Wachstum zeigt. Unten: Diagramm, das die durchschnittliche KBE / ml +/- SEM zeigt.ww.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig3.jpg" /> . Abbildung 3: Visualisierung der DNA - Replikation Intermediates bei einem Nucleoprotein - Block (A) genomischer DNA aus Zellen (1, - ara, 2, + ara, 3, + ara / AT) , die in Agarose - Stecker und verdaut mit EcoRV Restriktionsenzym lysiert wurde auf einem 0,4% Agarosegel aufgetrennt (55 V, 16 h). 3 kb, 5 kb und 10 kb Banden sind angegeben. Die DNA über dem 5 kb Marker wurde durch die weißen Felder wie angegeben ausgeschnitten. (B) Schematische Darstellung des EcoRV Digest der Array - Region. Replikationsgabeln das Array vom Ursprung innerhalb des 5,5 kb-Fragments blockiert werden eintritt, wenn die Zellen in Gegenwart von Arabinose angebaut. Die Restriktionsstellen durch Pfeile angegeben genutzt und der array ist als Kasten mit Linien dargestellt. (C) Die ausgeschnittene DNA wurde um 90 ° gedreht und in einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt (220 V, 4 h). Das weiße Feld zeigt die Exzision der DNA nach der Trennung. (D) Der Anordnungsbereich wurde anschließend durch Southern - Blot - Analyse unter Verwendung einer radioaktiven Sonde mit dem Anordnungsbereich visualisiert. Zellen , die mit einem Replikationsblock an dieser Position wird das Signal entsprechend dem 5,5 - kb - Fragment auf der Y-Bogen gelegen haben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System at JoVE.com

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in<i&gt; E. coli</i&gt; Ein fluoreszierendes Repressor Operator System verwenden

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

8.9K Aufrufe.  University of Newcastle. We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Serie: Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit dem Hitzeschock-Methode

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Forschung

Biologie

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

Principles of ortsspezifische Rekombinase (SSR)-Technologie

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualisierung Bakterien in Nematoden durch Fluoreszenzmikroskopie

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

Die Logik, Experimental Steps, und Potenziale Heterologe Naturstoffbiosynthese Ausgestattet mit dem Complex Antibiotikum Erythromycin A Through Produziert<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...