MG, MO'C and PC thank the Molecular Medicine Research Group at WSU for Research Seed Funding, as well as Michele Mason (WSU), Richard Wuhrer (Advanced Materials Characterisation Facility, AMCF, WSU) and Herv&#233; Cottet (Montpellier) for discussions.

1. Herstellung von Chitosanfilme <ol><li> Abwiegen 2 g Eisessig, komplett auf 100 ml mit Reinstwasser. </li><li> Man wiegt 1,7 g Chitosan-Pulver, 100 ml der 2% m / m Essigsäure wässriger Lösung. Rühren Sie für 5 Tage mit Rührstab und magnetische Rührplatte bei Raumtemperatur entweder mit Aluminiumfolie abgedeckt oder in der Dunkelheit. </li><li> Zentrifugieren Sie die Chitosan-Dispersion bei 1076 × g bei 23 ° C für 1 Stunde. Die überstehende Flüssigkeit mit einer Spritze und entsorgen Sie den Niederschlag. </li><li> Für jeden Film, Aliquot von 10 ml der Chitosan-Suspension in eine 9 cm Kunststoff-Petrischale bei Raumtemperatur. Lassen Sie die verdeckten Filme für mindestens 7 Tage trocknen. </li><li> Mit einer Schere schneiden Sie die trockenen Filme in 1 x 1 cm große Quadrate. Hinweis: Das Experiment kann in diesem Stadium angehalten werden. </li></ol> 2. Herstellung von Phosphat-gepufferter Saline (PBS) <ol><li> Man wiegt 8 g Natriumchlorid, 0,2 g Kaliumchlorid, 1,44 g Dinatriumhydrogenphosphat phosphat und 0,24 g Kaliumdihydrogenphosphat. </li><li> Man löst diese abgewogen Chemikalien in 800 ml Reinstwasser und titriert die Lösung mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,4. Hinweis: Das Experiment kann in diesem Stadium angehalten werden. </li></ol> 3. Herstellung von 75 mM Natriumboratpuffer bei pH 9,2 <ol><li> Man wiege 3,0915 g Borsäure. Man löst es in 75 ml Reinstwasser. </li><li> Titrieren die Borsäure Lösung auf einen pH von 9,2 mit einer Natriumhydroxid-Lösung bei einer Konzentration von 10 M oder höher. Achtung: Konzentrierte Natronlauge sind ätzend und sollte mit Handschuhen angefasst werden. </li><li> Komplett mit Reinstwasser zu erhalten 100 ml Lösung. Dies ergibt eine 500 mM Natriumboratpuffer bei pH 9,2. </li><li> Verdünne das 500 mM Natriumboratpuffer mit Reinstwasser bis 75 mM Natriumboratpuffer. Hinweis: Das Experiment kann in diesem Stadium angehalten werden. </li></ol> 4. Herstellung von Chitosan Films für die Pfropfreaktion <ol><li> Spülen 10 Quadrat Chitosanfilme (1 x 1 cm) in 5 ml PBS für 2 Stunden in einer Petrischale bei Raumtemperatur. </li><li> Während dieser Zeit vorzubereiten und die Kapillar-Elektrophorese-Instrument (Schritt 5) zu validieren. </li></ol> 5. Herstellung und Validierung der Kapillarelektrophorese Instrument <ol><li> Vorbereiten eines 43,5 cm bare Quarzglaskapillare mit einem Innendurchmesser von 50 &amp; mgr; m (43,5 cm beträgt die Gesamtlänge, die wirksame Länge zu dem Detektionsfenster wird in der Regel 35 cm), indem das Polymer äußeren Beschichtung der Kapillare Schwächung bei der eingestellten Länge mit einem stumpfe utensil schnappen dann die Kapillare. <ol><li> Erstellen eines Fenster für die Kapillare durch ein Feuerzeug mit Hilfe der Polymerbeschichtung bei 8,5 cm von dem Einlaß zu verbrennen und nach Abwischen kühlt es sauber mit Ethanol. Brennen Sie die Beschichtung der Kapillare an jedem Ende für ein paar Millimeter mit einem Feuerzeug, und nachdem sie abkühlt sauber wischen mit Ethanol. </li><li> Platz Kapillare inside Detektionsfenster und installieren in der Kapillarkassette indem sie bei gleichen Längen in dem Einlass und Auslass platziert und um die Spindeln der Wickelkassette. Installieren Sie dann die Kassette in der Kapillar-Elektrophorese Instrument. </li></ol></li><li> Die Parameter des Verfahrens für jede Trennung. Im Software-Menü wählen Sie &quot;Methode&quot;, dann &quot;das gesamte Verfahren zu bearbeiten&quot;. Stellen Sie die Temperatur, Zeit, Spannung und Phiolen für die Trennung verwendet wird (beispielsweise 25 ° C, 10 min, 30 kV). <ol><li> Im Abschnitt Präkonditionierung, stellen die aufeinanderfolgenden Spülungen: 10 min mit 1 M Natriumhydroxid (in Wasser), 5 min mit 0,1 M Natriumhydroxid (in Wasser), 5 min mit Reinstwasser und 5 min mit 75 mM Natriumboratpuffer bei pH 9,2 für die erste Methode einer Reihe von Analysen. </li><li> Für die folgenden Methoden, stellen Sie die Menge, die die aufeinanderfolgenden Spülungen in der Pre-Konditionierstrecke: 1 min mit 1 M Natriumhydroxid (in Wasser), 5 min mit 75 mM Natriumboratpuffer bei pH 9.2. </li><li> Im Injektionsabschnitt, eingestellte Parameter für einen hydrodynamischen Injektion mit 30 mbar Druck für 10 Sekunden für alle Methoden. In dem Trennabschnitt, stellen die Trennungsbedingungen zu 30 kV bei 25 ° C für 9 min für alle Methoden. HINWEIS: Bedienungsanleitung der spezifischen CE-Gerät als Verfahren finden Sie in der CE-Gerät für den Betrieb zwischen Herstellern variieren. Bereiten Sie die 1 M Natriumhydroxid-Lösung am Tag. </li></ol></li><li> Einschleusen und einen neutralen interner Standard trennen (10 &amp; mgr; l von 10% v / v Dimethylsulfoxid (DMSO), verdünnt in Wasser in 450 ul 75 mM Natriumboratpuffer). Dann spritzen und auf die gleiche Weise ein Oligoacrylat Standard trennen (gelöst in Reinstwasser bei 10 g ∙ L -1; siehe Liste der Materialien) , um die Gültigkeit der Kapillare zu überprüfen. Unterbrechen Sie die hier Sequenz, bis die Pfropfreaktion ist startbereit. </li></ol> 6. Verpflanzen von RGDS auf Chitosanfilms <ol><li> Wiegen Sie das Peptid (1 mg RGDS)und die Kopplungsmittel (3 mg EDC-HCl und 2 mg NHS). </li><li> 2 h nach dem Start der Chitosanfilm Einweichen in PBS, lösen sich das Peptid und das Kupplungsmittel in 5 ml PBS. <ol><li> Nehmen Sie ein 50-ul-Aliquot dieser Lösung. Hinzufügen 2 &amp; mgr; l von 10% v / v DMSO in Wasser als interner Standard neutral zum Aliquot. Analysieren Sie den aliquoten mit CE (siehe Schritt 7). </li></ol></li><li> Entfernen die 5 ml PBS verwendet, die Chitosan-Filme aus der Petrischale zu spülen. Fügen Sie die 5 ml-Lösung von Peptid und Kupplungsmitteln zu der Petrischale, die Chitosan-Filme enthält. </li><li> Decken Sie die Petrischale mit Paraffinfilm und legen Sie es auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. Bis zu 50 &amp; mgr; l-Aliquots von Reaktionsmedien zu festgelegten Zeiten. HINWEIS: Die Gesamtanalysezeit mit CE beträgt 15 min, wodurch ein Aliquot kann alle 15 min genommen werden (oder alle 30 Minuten , wenn zwei Reaktionen parallel überwacht werden, etc.). <ol><li> Hinzufügen 2 &amp; mgr; l von 10% v / v DMSO in Wasser als interner Standard neutral zu jedem aliquot. HINWEIS: Aliquots sollten so bald mit CE analysiert werden, da sie (siehe Schritt 7) getroffen werden. </li></ol></li><li> Nach 4 Stunden Schütteln und Aliquotentfernung, entfernen Sie die Petrischale aus dem Schüttler. Entfernen des Reaktionsmediums aus der Petrischale. 5 ml PBS, die Chitosan-Filme zu spülen. </li><li> Entfernen Sie die PBS aus der Petrischale, spülen Sie die Chitosan-Film mit Reinstwasser und lassen sie über Nacht trocknen. Entfernen Sie die Reinstwasser und speichern die Filme bei 20 ° C in einer Kunststoff-Petrischale. </li></ol> 7. Überwachung von Pfropfreaktion CE Verwendung <ol><li> Injizieren und getrennte Aliquots von Reaktionsmedien unmittelbar nach der Entnahme aus der Petrischale mit den Analysebedingungen wie in Abschnitt 5.2. </li><li> Nach Abschluss der Trennungen Spülen der Kapillare mit ultrareinem Wasser für 10 min. Trocknen Sie es durch einen Flush mit einem leeren Fläschchen (Luft) für 10 min. HINWEIS: Das Experiment kann in diesem Stadium angehalten werden. </li></ol> 8. Daten Trea<html> tment für CE <ol><li> Überprüfen Sie die Gültigkeit jeder Trennung, durch die Überprüfung sowohl der Strom während der Trennung und die Migrationszeit der elektroosmotischen Mobilität Marker (DMSO in diesem Fall) sind ähnlich denen, die für die Oligoacrylat Standardtrennung beobachtet. HINWEIS: Bis zu 10-15% Abweichung von dem erwarteten Stromwert von etwa 50 &amp; mgr; A und Migrationszeit-Wert von 1,3 min (elektrophoretische Mobilität Werte anstelle von Migrationszeiten verwendet werden sollte, wenn eine höhere Wiederholgenauigkeit erforderlich ist) akzeptabel ist. </li><li> Für jede erfolgreiche Trennung Exportieren Sie die Rohdaten von der Kapillar-Elektrophorese-Software durch einen bestimmten Datensatz der Auswahl Recht auf Export klicken und ein entsprechendes Signal auswählen. </li><li> Wandeln die Rohdaten von der CE aufgezeichnet (dargestellt als UV-Absorption als Funktion der Migrationszeit). Wandeln die X-Achse (Wanderungszeit t m) in eine elektrophoretische Mobilität μ folgenden Gleichung 1: n 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg &quot;/&gt; (1) wobei L d die Länge zum Detektor ist, L t die Gesamtlänge der Kapillare, V die Spannung ist, und t eo ist die Migrationszeit eines neutralen Spezies (der interne Standard DMSO in diesem Fall) 27. Wandeln die Y-Achse der Rohdaten (Extinktion in au) zu einer Verteilung der elektrophoretischen Mobilitäten W (μ) nach der Gleichung 2: 28 <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54549/54549eq2.jpg" /> (2) </li></ol> 9. Weitere Charakterisierung von Peptid-gepfropft Films 18 <ol><li> Legen Peptid-gepfropft Chitosanfilme, rollte um sich in einem 4 mm Festkörper-NMR-Rotor. Füllen den Rotor mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die Filme zu quellen, und den Rotor zu schließen. Warten Sie ein paar Stunden. </li><li> Analysieren Sie den Film mit 13 &lt;/ sup&gt; C - NMR - Spektroskopie 18. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Einfachheit des hier beschriebene Protokoll macht es ideal für eine breite Anwendung geeignet. Allerdings muss besonderes Augenmerk auf die folgenden wesentlichen Schritte zu zahlen. Proper CE Instrumentenaufbereitung Es ist wichtig, einen bekannten Standard unmittelbar vor der Trennung von unbekannten Proben (wie auch am Ende einer Reihe von Trennungen) zu trennen, um die Gültigkeit der Kapillare und Instrument am Tag zu überprüfen. Dies...

Freie Lösung Kapillarelektrophorese (CE) ist eine Technik , die Verbindungen in Lösungen auf der Basis ihrer Ladung-zu-Reibungsverhältnis 1,2 trennt. Ladungs-Größenverhältnis wird häufig in der Literatur erwähnt, aber diese Vereinfachung gilt nicht für Polyelektrolyte, einschließlich Polypeptiden in dieser Arbeit, und wurde auch für kleine organische Moleküle 3 nicht als geeignet gezeigt. CE unterscheidet sich von anderen Trenntechniken in, daß es nicht eine stationäre Phase hat, nur eine Hintergrundelektrolyt (normalerweise ein Puffer). Dies ermöglicht die Technik in seiner Fähigkeit , robust zu sein , eine große Auswahl an Proben mit komplexen Matrices 4 wie Pflanzenfasern 5, Fermentation Sude 6 Pfropfen auf synthetischen Polymeren 7, Lebensmittelproben 8 und kaum lösliche Peptide 9 ohne langwierige Probenvorbereitung zur Analyse und Reinigung. Dies ist besonders bedeutsam für komplexe Polyelektrolyte, die Auflösung Probleme haben (such als Chitosan 10 und Gellangummi 11) und existieren daher als aggregierte oder in Lösung ausgefällt und haben ohne Probenfiltration erfolgreich analysiert. Ferner ging es um die Analyse von Zuckern in Frühstückszerealien Proben mit Partikeln von Frühstück Getreideproben in Wasser 8 gefällt injiziert wird . Diese erstreckt sich auch auf die Analyse von verzweigter Polyelektrolyte oder Copolymere 12,13. Umfangreiche Arbeit wurde auch in der Entwicklung von CE - Techniken speziell für die Analyse von Proteinen für die Proteomik 14, chirale Trennung von natürlichen oder synthetischen Peptide 15 und Mikrochip - Trennungen von Proteinen und Peptiden 16 abgeschlossen ist. Da die Trennung und Analyse in einer Kapillare nehmen, sind nur kleine Volumina von Probe und Lösungsmittel verwendet , das CE ermöglicht eine niedrigere Betriebskosten als andere Trennverfahren einschließlich Chromatographie 5,6,17 haben. Da die Trennung durch CE schnell ist, erlaubt es die monitoRing der Reaktionskinetik. Dies wurde in dem Fall der Pfropfung von Peptiden auf Chitosan - Filme für verbesserte Zelladhäsion 18 gezeigt. Chitosan ist ein Polysaccharid aus der N -deacetylation von Chitin abgeleitet. Chitosan - Filme können solche für verschiedene biomedizinische Anwendungen verwendet werden , wie Bioadhäsive 19 und Zellwachstumssubstrate 18,20 aufgrund Chitosan der Biokompatibilität 21. Zellbindung an spezifische extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronektin, Kollagenen und Laminin, direkt 22 , um das Überleben der Zellen verbunden. Bemerkenswert ist, erfordern unterschiedliche Zelltypen oft Bindung an verschiedene extrazelluläre Matrixproteine ​​für das Überleben und die einwandfreie Funktion. Zellanheftung an Chitosan - Filme wurde durch das Pfropfen von Fibronektin 23 werden verstärkt dargestellt; jedoch Herstellung, Reinigung und Veredelung von solchen großen Proteinen ist nicht wirtschaftlich. Alternativ kann ein Bereich von kleinen Peptiden have wurde in der Lage gezeigt, die Eigenschaften der großen extrazellulären Matrixproteinen zu imitieren. Zum Beispiel Peptide wie die Fibronektin - Mimetika RGD (Arginin - Glycin - Asparaginsäure) und RGDS (Arginin - Glycin - Asparaginsäure - Serin) wurden die Zellbindung 24 verwendet zu erleichtern und zu erhöhen. Kovalentes Pfropfen von RGDS auf Chitosan - Filme zu einer verbesserten Zellanhaftung für Zellen in vivo 18 bis Fibronektin zu befestigen bekannt. Substituieren größere Proteine ​​gefällt Fibronektin mit kleineren Peptiden, die die gleiche Funktionalität stellt eine erhebliche Kostenreduzierung aufweisen. Hier Peptid an Chitosan Pfropfung wurde durchgeführt , wie zuvor 18 veröffentlicht. Wie zuvor gezeigt, bietet dieser Ansatz eine einfache und effiziente Pfropfen durch die Kupplungsmittel EDC-HCl (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) und NHS (N - Hydroxysuccinimid) unter Verwendung der Carbonsäure der RGDS zu funktionalisieren zu sein auf das gepfropfteChitosan-Film. Zwei Vorteile dieses Pfropfverfahren sind , dass es keine Änderung des Chitosans benötigt oder des Peptids, und es wird in wäßrigem Medium durchgeführt zu maximieren Kompatibilität mit zukünftigen Zellkulturanwendungen 18,20. Als Kupplungsmittel und das Peptid aufladbar ist, ist CE ein geeignetes Verfahren für die Analyse der Reaktionskinetik. Wichtig ermöglicht, die Analyse der Reaktionskinetik mittels CE Echtzeit-Überwachung der Pfropfreaktion, und ermöglicht damit sowohl der Optimierung und der Pfropfgrad zu quantifizieren. Während es nicht routinemäßig erforderlich ist, können die Ergebnisse der CE - Analyse durch eine direkte Messung des Peptids off-line überprüft werden Pfropfung auf die Chitosan - Filme unter Verwendung von Festkörper-NMR (kernmagnetische Resonanz) -Spektroskopie 25,26 , um die kovalente Pfropfung demonstrieren des Peptids auf den Film 18. Doch im Vergleich mit Festkörper-NMR-Spektroskopie, die Echtzeit-Analyse zur Verfügung gestellt vonCE ermöglicht die Quantifizierung des Peptids Verbrauch in Echtzeit und damit die Fähigkeit, die Kinetik der Reaktion zu bewerten. Das oben erwähnte Verfahren ist einfach und ermöglicht die Echtzeit-Analyse von Peptid auf Chitosan-Filme mit indirekter Quantifizierung des Ausmaßes der Pfropfung Pfropfung. Die aufgezeigte Methode kann zur Echtzeit-quantitative Bewertung verschiedener chemischer Reaktionen verlängert werden, solange die Reaktanden oder die Produkte analysiert werden können berechnet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1124">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Water</td>
			<td style="width:185px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:479px;">All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Chitosan powder (medium molecular weight)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>448877</td>
			<td style="width:479px;">lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic acid - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td style="width:119px;">2-2.5L GL</td>
			<td>laboratory reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4540</td>
			<td>laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221465&#160;</td>
			<td>laboratory reagent, corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RGDS&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:119px;">H&#8208;1155</td>
			<td>peptide, bought from Auspep Pty Ltd</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D80002</td>
			<td>Irritant to skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-hydroxysuccinimide&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">130672</td>
			<td>Irritant to skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>466-500G</td>
			<td>laboratory reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride - Univar</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>384-500G</td>
			<td>analytical reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium hydrogen phosphate - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>1234-500G</td>
			<td>laboratory reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium dihydrogen phosphate - Univar</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td>4745-500G</td>
			<td>analytical reagent, slight skin irritant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Oligoacrylate standard</td>
			<td style="width:185px;">custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:479px;">See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid&#160;</td>
			<td style="width:185px;">BDH AnalR, Merck Pty Ltd</td>
			<td style="width:119px;">10058</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid - Unilab</td>
			<td style="width:185px;">Ajax Finechem</td>
			<td style="width:119px;">A1367-2.5L</td>
			<td>laboratory reagent, corrosivie</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fused silica tubing</td>
			<td style="width:185px;">Polymicro (Molex)</td>
			<td style="width:119px;">TSP050375</td>
			<td style="width:479px;">Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 &#181;m internal diameter, 363 &#181;m outer diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent 7100 CE</td>
			<td style="width:185px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G7100CE</td>
			<td>Capillary electrophoresis instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaker&#160;</td>
			<td style="width:185px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;">KS260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Electronic balance</td>
			<td style="width:185px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:119px;">MS204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Milli-Q Synthesis&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ZMQS5VF01</td>
			<td>Ultrapure water filtration system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Parafilm&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Labtek</td>
			<td style="width:119px;">PM966</td>
			<td>Parrafin wax</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis to monitor peptide grafting onto chitosan films in real time

Free-Lösung Kapillarelektrophorese (CE) trennt Analyten, im allgemeinen geladenen Verbindungen in Lösung durch die Anwendung eines elektrischen Feldes. Im Vergleich zu anderen analytischen Trenntechniken, wie Chromatographie, ist CE billig, robust und erfordert effektiv keine Probenvorbereitung (für eine Reihe von komplexen natürlichen Matrices oder polymere Proben). CE ist schnell und kann verwendet werden , die Entwicklung der Mischungen in Echtzeit zu verfolgen (beispielsweise chemische Reaktionskinetik), da die Signale für die abgetrennten Verbindungen beobachtet direkt proportional zu ihrer Menge in Lösung. Dabei wird die Effizienz der CE gezeigt, zur Überwachung der kovalente Pfropfung von Peptiden auf Chitosan-Filme für nachfolgende biomedizinische Anwendungen. Chitosan ist antimikrobiell und biokompatiblen Eigenschaften machen es zu einem attraktiven Material für biomedizinische Anwendungen wie Zellwachstumssubstrate. Kovalent Pfropfen der Peptid RGDS (Arginin - Glycin -Asparaginsäure - Serin) auf die Oberfläche des Chitosanfilme zielt auf die Zellanheftung zu verbessern. Historisch haben Chromatographie und Aminosäureanalyse wurde eine direkte Messung der Menge des aufgepfropften Peptid bereitzustellen, verwendet. Jedoch ermöglicht die schnelle Trennung und Abwesenheit von Probenvorbereitung durch CE vorgesehen gleichermaßen genaue noch eine Echtzeitüberwachung des Peptids Pfropfverfahren. CE ist in der Lage, die verschiedenen Komponenten der Reaktionsmischung abzutrennen und zu quantifizieren: Die (nicht gepfropften) -Peptid und die chemischen Kupplungsmittel. Auf diese Weise führt die Verwendung von CE in verbesserte Folien für Downstream-Anwendungen. Die Chitosan-Filme wurden charakterisiert durch Festkörper-NMR (kernmagnetische Resonanz) -Spektroskopie. Diese Technik ist zeitraubend und kann nicht in Echtzeit angewendet werden, aber eine direkte Messung des Peptids ergibt und somit validiert die CE-Technik.

CE ist gut geeignet , um die Transplantation von Peptiden zur Überwachung (zB RGDS) auf Chitosan - Filme. Geeignete Kupplungsmittel schließen EDC-HCl und NHS , die das Peptid zu aktivieren , auf dem Chitosan (Abbildung 1) gepfropft werden. CE ist in der Lage, die verschiedenen Moleküle von Interesse aus dem Reaktionsmedium abzutrennen. Um die Peaks auf der Elektropherogramm, reine RGDS, EDC-HCl und NHS vergeben wurden aufgelöst, injiziert und separat getrenn...

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Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Kapillarelektrophorese zum Monitor Peptid Verpflanzen auf Chitosanfilme in Echtzeit

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

capillary-electrophoresis-to-monitor-peptide-grafting-onto-chitosan

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.0K Aufrufe.  Western Sydney University. Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Serie: Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

A Technique to Functionalize and Self-assemble Macroscopic Nanoparticle-ligand Monolayer Films onto Template-free Substrates

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and scalable technique efficiently functionalizes metallic nanoparticles with thiol-ligands in a miscible water/organic solvent mixture allowing for rapid grafting of thiol groups onto the gold nanoparticle surface. The hydrophobic ligands on the nanoparticles then quickly phase separate the nanoparticles from the aqueous based suspension and confine them to the air-fluid interface. This drives the ligand-capped nanoparticles to form monolayer domains at the air-fluid interface.&#160; The use of water-miscible organic solvents is important as it enables the transport of the nanoparticles from the interface onto template-free substrates.&#160; The flow is mediated by a surface tension gradient3,4 and creates macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle-ligand films.&#160; This self-assembly technique may be generalized to include the use of particles of different compositions, size, and shape and may lead to an efficient assembly method to produce low-cost, macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle films for wide-spread applications.

A simple, robust and scalable technique to functionalize and self-assemble macroscopic nanoparticle-ligand monolayer films onto template-free substrates is described in this protocol.

Eine Technik, um auf Vorlage freie Substrate zu funktionalisieren und Selbstorganisation makroskopische Nanopartikel-Liganden-Monolayer Films

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and ...

Forschung

Chemie

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1&#945; (Stromal cell-derived factor-1&#945;), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1&#945;-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1&#945; is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1&#945;, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1&#945; from the nanoparticles.

Herstellung und Charakterisierung von SDF-1α-Chitosan-Nanopartikel Dextransulfat

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Cooling Rate Dependent Ellipsometry Measurements to Determine the Dynamics of Thin Glassy Films

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements are simple high-throughput characterization experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glassy states for a variety of glassy materials. This technique allows for these parameters to be measured in a single experiment, while other methods must combine a variety of different techniques to investigate all of these properties. Measurements of dynamics close to Tg are particularly challenging. The advantage of cooling rate dependent Tg measurements over other methods which directly probe bulk and surface relaxation dynamics is that they are relatively quick and simple experiments, which do not utilize fluorophores or other complicated experimental techniques. Furthermore, this technique probes the average dynamics of technologically relevant thin films in temperature and relaxation time (&#964;&#945;) regimes relevant to the glass transition (&#964;&#945; &#62; 100 sec). The limitation to using ellipsometry for cooling rate dependent Tg experiments is that it cannot probe relaxation times relevant to measurements of viscosity (&#964;&#945; &#60;&#60; 1 sec). Other cooling rate dependent Tg measurement techniques, however, can extend the CR-Tg method to faster relaxation times. Furthermore, this technique can be used for any glassy system so long as the integrity of the film remains throughout the experiment.

Here, we present a protocol for cooling rate dependent ellipsometry experiments, which can determine the glass transition temperature (Tg), average dynamics, fragility and the expansion coefficient of the super-cooled liquid and glass for a variety of glassy materials.

Kühlrate Dependent Ellipsometriemessungen die Dynamik des Thin Glassy Films zu ermitteln

This report aims to fully describe the experimental technique of using ellipsometry for cooling rate dependent Tg (CR-Tg) experiments. These measurements ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

Schnelle Hochdurchsatz-Spezies Identifizierung von Pflanzen von Material mit Direktanalyse in Echtzeit hochauflösender Massenspektrometrie

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

Mit Hilfe der Kapillarelektrophorese organischen Säuren aus Pflanzengewebe zu beziffern: ein Test Untersuchen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Saatgut

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Grafting Multiwalled Carbon Nanotubes with Polystyrene to Enable Self-Assembly and Anisotropic Patchiness

We demonstrate a straightforward protocol to graft pristine multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) with polystyrene (PS) chains at the sidewalls through a free-radical polymerization strategy to enable the modulation of the nanotube surface properties and produce supramolecular self-assembly of the nanostructures. First, a selective hydroxylation of the pristine nanotubes through a biphasic catalytically mediated oxidation reaction creates superficially distributed reactive sites at the sidewalls. The latter reactive sites are subsequently modified with methacrylic moieties using a silylated methacrylic precursor to create polymerizable sites. Those polymerizable groups can address further polymerization of styrene to produce a hybrid nanomaterial containing PS chains grafted to the nanotube sidewalls. The polymer-graft content, amount of silylated methacrylic moieties introduced and hydroxylation modification of the nanotubes are identified and quantified by Thermogravimetric Analysis (TGA). The presence of reactive functional groups hydroxyl and silylated methacrylate are confirmed by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Polystyrene-grafted carbon nanotube solutions in tetrahydrofuran (THF) provide wall-to-wall collinearly self-assembled nanotubes when cast samples are analyzed by transmission electron microscopy (TEM). Those self-assemblies are not obtained when suitable blanks are similarly cast from analogous solutions containing non-grafted counterparts. Therefore, this method enables the modification of the nanotube anisotropic patchiness at the sidewalls which results into spontaneous auto-organization at the nanoscale.

A procedure for the synthesis of polystyrene-grafted multiwalled carbon nanotubes using successive chemical modification steps to selectively introduce the polymer chains to the sidewalls and their self-assembly via anisotropic patchiness is presented.

Pfropfen Multiwalled Carbon Nanotubes mit Polystyrol Selbstmontage ermöglichen und anisotropen führt

We demonstrate a straightforward protocol to graft pristine multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) with polystyrene (PS) chains at the sidewalls through a ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Echtzeit-Atem-Analyse mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation mit hochauflösenden Massenspektrometrie gekoppelt

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Mikrosonde Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry für einzellige Metabolomik in Live-Frosch (Xenopus Laevis) Embryonen

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillare Zone Elektrophorese Tandem-Massenspektrometrie

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

High-Throughput und umfassende Droge-Überwachung mittels Massenspektrometrie Multisegment-Injektion-Kapillar-Elektrophorese

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Kapillarelektrophorese zum Monitor Peptid Verpflanzen auf Chitosanfilme in Echtzeit

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