Name: utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures
Uploaded: 2016-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures at JoVE.com

The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).

1. Herstellung von 96-Well-Platten siRNA HINWEIS: Die Außenkanten einer 96-Well-Platte sind anfälliger für Verdampfung im Vergleich zu anderen Vertiefungen begrenzen somit die Menge an siRNAs bis 60 pro 96-well-Platte. Füllen Sie äußere Brunnen mit klarem Medium oder PBS diese zu begrenzen. Darüber hinaus wird ein Validierungs Bildschirm Zugriffe empfohlen Platte Vorurteile zu lindern. <ol><li> Verdünnen Sie die siRNAs auf 250 bis 500 ng / &amp; mgr; l in reduzierten Serummedium (gemäß den Empfehlungen des Herstellers) und aliquote 10 ul in die entsprechenden Vertiefungen der Ultra-Low-Befestigungsplatte. Führen Sie alle Bildschirme in dreifacher Ausfertigung. HINWEIS: Integrieren geeigneten nicht-Targeting (negativ) und zu töten (positiv, wie UBB und PLK1) siRNA Kontrollen in der Plattendesign Transfektionseffizienz, um sicherzustellen, beurteilt werden. Die Verwendung von Low-Befestigungsplatten für die siRNA Arbeit kritisch ist, als Zellen zur Transfektion Mischung gegeben werden. Wir können nicht ausschließen, dass einige Hersteller Ultra-Low-BefestigungPlatten können subtile Effekte auf Sphäroid Wachstum haben. Als solches empfehlen wir, dass diese durch den Endverbraucher getestet werden. </li><li> Abdeckplatten mit Klebedichtungen und bei -20 ° C. </li></ol> 2. Reverse-Transfektion von Zelllinien <ol><li> Am Tag des Bildschirms, auftauen die Platten bei Raumtemperatur und Spin für 5 min bei 1000 × g eine Tischzentrifuge verwenden. In 10 ul reduziert Serum-Medium, das die optimierte-Transfektionsreagenz in jede Vertiefung einer Mehrkanalpipette mit. Lassen Platten für 15 min zur Transfektion Komplexe, die siRNA zu bilden. ANMERKUNG: Diese Studie der Brustkrebs-Zelllinie BT474 für funktionelle genomische Screening (kultiviert in glucosereichem DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika) verwendet. </li><li> Verwendung geeigneten Volumen Zellinie spezif trypsinize die Zellen gescreent werden (0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA), bis sie aus dem Kolben abzulösen, Neutralisierenic Medium und Spin für 5 min bei 1000 × g auf einer Tischzentrifuge Trypsin zu entfernen. Die Zellen mit einem geeigneten Volumen des Mediums und bestimmen Anzahl genaue Zelle einen Zellenzähler verwendet wird. HINWEIS: In der Regel 5.000 Zellen pro Vertiefung für Sphäroidformation getestet in den meisten Zelllinien ausreichend sind. Es ist wichtig, genau die Zellen als eine Einzelzellsuspension für die genaue Größenvergleiche zählen. </li><li> Verdünnte Zellen zu 5000 Zellen pro 180 &amp; mgr; l in kaltes Medium (4 ° C). HINWEIS: Die Zugabe von rekonstituierten Basalmembran Matrixkomponenten werden negativ Transfektionseffizienz auswirken und es wird empfohlen, dass es nicht verwendet wird. Die Zelllinie Optimierung Sphäroid Bildungsfähigkeit und Zuschlags Wirksamkeit zu bestätigen, sollte vor dem Bildschirm ausgeführt werden. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Reservoir, Pipette zu mischen und fügen 180 ul zu jeder Vertiefung der 96-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte enthält, die siRNA zuvor hergestellten (2.1). </li><li> Centrifuge die Platte bei 1000 xg in einer vorgekühlten Zentrifuge 4 ° C für 10 min und dann wieder auf 37 ° C Gewebekultur-Inkubator. </li><li> HINWEIS: Die Zellen als Mosaik im Boden der Vertiefungen erscheinen. Im Laufe der nächsten 12 - 24 h aggregieren die Zellen zusammen eine einzelne Kugel zu bilden. </li><li> Nach 24 h beobachten die Zellen in der Mitte des Brunnens eine einzelne Sphäroid bilden. Je 100 &amp; mgr; l Vollmedium zu jeder Vertiefung Wachstum zu fördern. </li><li> Füllt Medium nach drei Tagen. Entfernen Sie vorsichtig 100 ul Medium aus jeder Vertiefung und mit 100 &amp; mgr; l frisches Medium. </li><li> Am Tag 7 quantifizieren die automatisierte Sphäroid Größe auf einem Plattenlesegerät, das quantitativ Sphäroid Wachstum im Laufe der Zeit zu überwachen (siehe Abschnitt 3). </li><li> Danach bestimmen Lebensfähigkeit Zelle eines lumineszenten die Lebensfähigkeit der Zellen Farbstoff (siehe Abschnitt 4) verwendet wird. </li></ol> 3. Automatische Bildaufnahme <ol><li> Scannen Sie die Platten auf einem Tisch-Mikro-Well-Platte Zytometers am 7. Tag. <ol> &lt;li&gt; Öffnen Sie die Software, wählen Sie die folgenden Schritte aus: &#39;96 -well Platte &quot;, wählen Sie den entsprechenden Typenschild und geben Sie einen Testnamen. HINWEIS: Alle zusätzlichen Informationen auch in die Software hinzugefügt werden können. </li><li> Wählen Sie die &#39;Tumorsphere&#39; Anwendung. Ändern Sie den Fokus, so dass der Sphäroid im Fokus und hat einen optimalen Kontrast. HINWEIS: Wir empfehlen &#39;Bild basiert Fokus &quot;als bedeutende Schwankungen in Sphäroid Größen zu erwarten sind. </li><li> Wählen Sie die Brunnen, die Abtastung erfordern und &quot;Scan starten&quot;. </li><li> Mit der Platte Scanner-Software, stellen Sie sicher, dass die Objektmaske genau die Sphäroid Größe darstellt. Tun Sie dies , indem Sie die Koloniedurchmesser, Grenzerweiterung, Mindeststärke und Präzision Einstellungen anpassen, die spezifisch für jede Zelllinie getestet 11,12. HINWEIS: Der Sphäroid Bereich wird dann berechnet werden, um die Software-Algorithmus. Zum Beispiel, um genau den Bereich des BT474 Sphäroiden berechnen für sieben Tage einstellen Präzision zu &quot;hoch&quot; ein gewachsend die minimalen Koloniedurchmesser bis 200 &amp; mgr; M. Dies sollte eine geeignete Sphäroid Maske Vertreter der Sphäroid-Bereich erzeugen. HINWEIS: Diese Daten können dann von der Maschine ausgeführt werden, die Export-Funktion verwenden, in der Form eines kommentierten Datendatei. Datum ist Platte Median normalisiert, kombiniert und analysiert entweder durch Z-Score oder streng standardisierte mittlere Differenz (SSMD) siRNAs zu identifizieren, die einen statistisch signifikanten Effekt auf Sphäroid Bereich hatte. </li></ol></li></ol> 4. Bestimmung der Zell Viability <ol><li> Nach Sphäroid Bereich berechnet worden ist, bestimmen die Lebensfähigkeit eines lumineszenten Zelle Lebensfähigkeit Farbstoff verwendet. Bereiten Sie das Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig 100 ul Medium aus jeder Vertiefung und mit 100 &amp; mgr; l der Lebensfähigkeit Farbstoff. Die Platten für 15 Minuten dann scannen Sie ein Leuchtplattenlesegerät verwendet wird. HINWEIS: Diese Daten können dann von der Maschine ausgeführt werden, die Export-Funktion verwenden, in indie Form eines kommentierten Datendatei. Datum ist Platte Median normalisiert, kombiniert und analysiert entweder durch Z-Score oder streng standardisierte mittlere Differenz (SSMD) siRNAs zu identifizieren, die einen statistisch signifikanten Effekt auf Sphäroid Lebensfähigkeit hatte. </li></ol>

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Dreidimensionale Modelle von Krebs werden zunehmend eingesetzt, um die Wirksamkeit von bekannten und neuen Verbindungen zu bewerten, die entworfen wurden, um selektiv Krebszellen abzutöten. Krebszelle Sphäroiden sind Strukturen , die Bedingungen mehr ähnlich denen begegnet in Tumoren in vivo zeigen, so dass Verbindungen , die Wirksamkeit in 3D erhöht haben , sind eher eine Wirkung in vivo zu haben. Allerdings sind diese Modalitäten nicht zur Identifizierung von potentiell neuen Targets ermöglichen, die nicht Gegenstand der Wirkstoffdesign bekannt ist, dass erhebliche Wirksamkeit bei der Behandlung von Krebs haben kann. Wir entwickelten eine siRNA funktionellen Genomik Ansatz, der für bis zu sieben Tage in der Krebszelllinie Sphäroiden für langlebige Gen-Silencing erlaubt. Es gibt mehrere wichtige Schritte des Protokolls, die eine Optimierung erfordern, bevor ein siRNA-Bildschirm durchgeführt werden kann. Die Fähigkeit, in einem großen Maßstab reproduzierbar tragfähige Sphäroiden zu bilden, ist wesentlich. Darüber hinaus ist einppropriate Transfektionsbedingungen sollte konsequent optimiert werden. Wir schlagen vor, trialing verschiedene Transfektionsreagenzien mit geeigneten nicht-Targeting und Kontrollen vor dem Versuch den Bildschirm zu töten. Wir konnten zeigen, dass viele häufig verwendete Brustkrebs-Zelllinien zu zeigen, nämlich BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 und JIMT1 zu siRNA-Transfektion zugänglich waren. Darüber hinaus haben wir Proof-of-Prinzip liefern Daten Screening der 200 am häufigsten mutierten Gene bei Brustkrebs in BT474 Sphäroiden, bestätigt ihre Abhängigkeit von Amplifikation von HER2 und onkogene Mutation von PIK3CA. Interessanterweise silencing des Transkriptionsfaktors FOXO3 führte zu einer Verringerung in Sphäroid Größe, aber keine signifikante Wirkung auf die Lebensfähigkeit. FOXO3 ist bekannt , die als Reaktion auf Hypoxie zu regulieren, die metabolische Kapazität von Krebszellen , so dass sie zu verändern 16 leichter an ihre Umgebung anzupassen. Diese Rolle könnte möglicherweise mit der Lebensfähigkeit der Zellen Lesen stören, wie es ATP Fülle erkennt, Einer der wichtigsten Produkte des Zellstoffwechsels. Zur Unterstützung der Beobachtung einer Reduktion in Sphäroid Größe wurde gefunden , dass Silencing FOXO3 in HeLa gezeigt, Tumorwachstum und Apoptose induziert 17 beeinträchtigt Xenotransplantaten. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Gene die Fähigkeit von Krebszellen beeinflussen können ihre 3D-Architektur zu erhalten, die in False Positives führen könnte. Beispielsweise Zuschlags von E-Cadherin in Folge der Auflösung von BT474 Sphäroid Struktur. Dies hatte zuvor berichtet E-Cadherin - Antikörper durch gezielte 18. Wie bei jedem Screening-Plattform sollten potenzielle Ziele, um die Reproduzierbarkeit der Wirkung beobachtet zu beurteilen, werden gescreent. Es gibt Grenzen für die Technik, nämlich die vorübergehende Natur der siRNA-vermittelten Knock-Down. Sustained zum Schweigen zu bringen länger als sieben Tage nicht erreichbar mit siRNA. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es mit verschiedenen anderen Biom gekoppelt werden kann,tric Farbstoffe diese nicht nur die Sphäroid Lebensfähigkeit beurteilen zu können, zum Beispiel, räumliche Informationen von Sphäroid Hypoxie zu geben oder Apoptose durch Überwachung Zellen. Darüber hinaus, weil die Plattenleser Scans relativ schnell und nicht-invasiv sind, kann die Wirkung von siRNAs auf Sphäroid Größe im Laufe der Zeit nicht nur an der experimentellen Endpunkt bewertet werden. Tatsächlich untersuchen wir derzeit mehrere dieser Möglichkeiten innerhalb unserer Screening-Pipeline. Ein alternativer Ansatz, die 3D-Kulturen nutzt neue Abhängigkeiten zu identifizieren, ist die Verwendung von chemischen Bibliotheken, die entweder ein breites Spektrum von Zielen oder bestimmte Familien von Proteinen hemmen. Tatsächlich Bitler et al. Diese gezielte Ansatz genutzt , um die synthetische Letalität Interaktion zwischen ARID1A Status und EZH2 - Inhibitoren in ovarian klarzelligen Karzinomen 19 zu identifizieren. Die Entdeckung des CRISPR-Cas9 Gen Bearbeitungstechnologie hat zur Entwicklung von genetischen Screens in organoiden Kulturen und in vivo ebenfalls erlaubt. Jedoch tSein Ansatz ist auf mit geeigneten Tieranlagen abhängig und 20 unerschwinglich teuer werden kann. Abschließend glauben wir , dass wir ein Protokoll dargelegt haben , dass genauer modelliert die Sauerstoff- und Nährstoff Gradienten, die Merkmale der Tumor - Mikroumgebung in vivo sind, so dass für die Identifizierung von neuen Targets bei Krebs oder robuste Validierung von festgelegten Zielen. Außerdem kann unser Protokoll für jede Art von Zelllinie angewendet werden, die Sphäroide und somit bildet, kann routinemäßig in der Gemeinschaft der Krebsforschung für siRNA Hochdurchsatz-Screens verwendet werden.

Solide Tumoren zeigen signifikante histologischen, genetischen und mikroUmwelt intratumorale Heterogenität, die Patienten in der Lage, Klinikern eine große Herausforderung stellt erfolgreich zu behandeln. Die Mehrzahl der Modelle Roman zu identifizieren, zielgerichtete Therapien integrieren nicht viele dieser Funktionen. Tatsächlich aktuellen zielgerichtete Therapien in der Klinik verwendet wurden in den letzten zehn Jahren beschäftigt Screening Ansätze entwickelt, die unter zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen auf Krebszelllinien angewiesen gezüchtet. Obwohl dies über verschiedene Erfolge, wie Rezeptor - Tyrosin - Kinase - Inhibitoren gebracht hat, wird immer offensichtlich , dass komplexere Modelle von Krebs erforderlich sind , um vollständig die Faktoren erkennen , die Tumorigenese in vivo und erhöhen die Anzahl neuer Therapien fahren , die den Übergang von vorklinischen Modellen zu klinischen Studien. Darüber hinaus ist es nun auch ersichtlich , dass 2D - Kultursysteme zu reflektieren scheiternvivo Verhalten 1,2. Zum Beispiel in schlecht vaskularisierten Tumoren, da die Nachfrage nach Sauerstoff und Nährstoffen in der Mikroumgebung überflügeln Versorgung, Regionen mit hoher und niedriger Lieferungen entwickeln. Die Anwesenheit von geringen Sauerstoff (Hypoxie) in Tumoren, wie durch die immunhistochemische Färbung von Tumorschnitten für etablierte hypoxischen Marker wie Carboanhydrase IX (CAIX) detektiert wird , korreliert mit einem schlechteren klinischen Ergebnis in Brustkrebs 3,4 Somit beinhaltet Funktionen wie Hypoxie in Screening - Modelle verbessern können unsere Fähigkeit , neue Angriffspunkte für Medikamente zu entdecken , die in vivo wirksamer sein wird. Tatsächlich erfolgreich Targeting aggressive Tumoren , die Hypoxie enthalten ist eine klinische Priorität 5. Die Verfälschung von herkömmlichen 2D-siRNA-Screening, in einem Versuch, genauer Elemente der von den Krebszellen in der Tumormikroumgebung angetroffen Bedingungen rekapitulieren, hat zur Identifizierung mehrerer Gene führte that wurden für das Tumorwachstum in vivo wichtig erwiesen. Dazu gehören funktionelle Genom Bildschirme durchgeführt unter niedrigen Serum - Bedingungen 6, hypoxischen Bedingungen 7 und in Kombination 8. Zum Beispiel silencing von 6-Phosphofructo-2-Kinase / Fruktose-2,6-bisphosphatase 4 (PFKFB4), ein Protein verantwortlich für die Regulierung Kohlenstoff eintritt Glykolyse, nur apoptosis in Prostatakarzinom Linien von Metastasierung abgeleitet induziert, wenn in niedrigen Serum gezüchtet. Silencing von PFKFB4 in normalen Prostatazelllinien unter den gleichen Bedingungen hatte keine Wirkung, während Erschöpfung der PFKFB4 vollständig das Wachstum von Prostata - Krebszelllinie Xenotransplantaten 6 abgetragenen. In einer erweiterten Gruppe von Brustkrebs-Zelllinien, führte das Silencing von mono-Carboxylase Transporter 4 (MCT4) bevorzugt zur Verringerung der Zelllinie Wachstum unter den Bedingungen der niedrigen Sauerstoff. Diese Schwachstelle wurde in vivo in Brustkrebs-Zelllinie orthotroper xenogra validiertfts. Vielleicht auffallend meisten Silencing von Acetyl-CoA-Synthetase-2 (ACSS2), ein Enzym, das zur Umwandlung von Acetat in Acetyl-CoA, reduziert Krebszellzahl unter Nährstoffstressbedingungen (niedrige Sauerstoff und Serum), aber hatte wenig oder keine Wirkung unter normalen Kulturbedingungen 8. Abtragung von ACSS2 beeinflusst das Wachstum von Brust- und Prostatakrebs Xenotransplantaten was darauf hindeutet , dass die Nährstoff Gradienten existieren nicht isoliert in der Tumor - Mikroumgebung und dass Zellen , die 8 für die Tumorprogression wesentlich in diesen Regionen befinden sind. Darüber hinaus 9,10, was darauf hindeutet , dass eine erhöhte ACSS2 Aktivität in Tumoren könnte ein grundlegender Mechanismus sein , dass das Wachstum unter ungünstigen Bedingungen unterstützt als wichtig bei Glioblastom und hepatozellulären Karzinomen ACSS2 wurde auch gefunden. Zusammengefasst beweisen diese Studien , dass die Bedingungen in vivo angetroffen rekapituliert und Durchführung siRNA - Bildschirme für die Identifizierung von g erlaubtenen von wesentlicher Bedeutung für Krebs Überleben. Neben 2D - Wachstum von Krebszellen unter Nährstoffstressbedingungen beeinflussen, Erschöpfung von Zielgenen in diesen Studien gehemmt Sphäroid Wachstum Krebszelllinie, Spiegeln , was in Tumorxenografte 6,8 beobachtet wurde. So enthalten Krebszelllinie Sphäroiden mehrere der Bedingungen im Tumormikromilieu angetroffen, die Empfindlichkeit gegenüber ACSS2 Silencing verleihen. Tatsächlich zeigen Sphäroide Nährstoff Gradienten (Serum und Sauerstoff), Veränderungen in pH, dreidimensionale (3D) Zell-Zell-Kontakt, sondern auch Veränderungen in proliferative celerity mit Zellen, Zellzyklusarrest und Apoptose unterzogen. Dies wird veranschaulicht durch die Anwesenheit in Krebs Sphäroide nekrotischer Bereiche, ein Merkmal nicht in herkömmlichen 2D-Kultur gefunden. kleine Molekül-Inhibitoren zu screenen, aber dies ermöglicht nur für die Validierung der Verbindung Wirksamkeit oder die Umwidmung von Kompo Krebszelle Sphäroiden wurden bereits als biologisch relevanten Modelle verwendet wordenunds ursprünglich entwickelt für andere Krankheiten 11. Strom Sphäroid Screeningverfahren für die Analyse von spezifischen Gens Verarmungs nicht in einem Hochdurchsatz-Hoch Gehalt Weise ermöglichen. Hier beschreiben wir zum ersten Mal, eine funktionelle Genomik-Pipeline für die Aufdeckung spezifischer Gen-Abhängigkeiten unter Verwendung von small interfering RNA (siRNA) Technologie in der Krebszelllinie Sphäroiden. Wir haben eine maßgeschneiderte Bibliothek mit siRNAs die 200 am häufigsten mutierten Gene in menschlichen Brustkrebs und bewertet die Auswirkungen der Gen-Depletion auf Sphäroid Größe und die metabolische Aktivität in BT474 Brustkrebs Sphäroiden Targeting. Wir konnten robust und reproduzierbar die Auswirkungen von ERBB2 und PIK3CA-Silencing in 3D Kulturen erkennen. Außerdem konnten wir die Auswirkungen von Gen Depletion auf die räumliche Architektur von BT474 Sphäroide beurteilen Immunhistochemie.

<table><tbody><tr><td>Lullaby</td><td>Oz Biosciences</td><td>LL70500&amp;nbsp;</td><td>lipid-based transfection reagent</td></tr><tr><td>Viromer</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td>virus-like polymer transfection reagent</td></tr><tr><td>Ultra-low attachment plate</td><td>Corning</td><td>CLS7007</td><td>96 well plate</td></tr><tr><td>Foil plate seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Luminescent cell viability dye</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>CellTitre-Glo</td></tr><tr><td>Pipette tips (200 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (10 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (1, 000 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (10 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>GIBCO</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Feta bovine serum</td><td>GIBCO</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>Cherry picked library</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelom</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5</td><td>Perkin Elmer</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert Inverted brightfield microscope</td><td>Zeiss</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Incubator</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mulitichannel pipette</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures

Die Identifizierung von funktionellen Fahrer Ereignisse in der Krebstherapie ist von zentraler Bedeutung, unser Verständnis der Krebsbiologie und unverzichtbar für die Entdeckung der nächsten Generation neuartiger Medikamente zu fördern. Es zeichnet sich ab, dass komplexere Modelle von Krebs sind vollständig erforderlich , um die Faktoren zu schätzen wissen , die Tumorentstehung in vivo fahren und die Wirksamkeit neuer Therapien erhöhen, die den Übergang von der präklinischen Modellen zu klinischen Studien zu machen. Hier präsentieren wir eine Methode zur Erzeugung von gleichmäßigen und reproduzierbaren Tumorsphäroide, die siRNA funktionelles Screening unterzogen werden kann. Diese Sphäroiden zeigen viele Merkmale, die in soliden Tumoren gefunden werden, die in der traditionellen Kultur Zwei-Dimension nicht vorhanden sind. Wir zeigen, dass mehrere häufig verwendete Brustkrebszelllinien zu diesem Protokoll zugänglich sind. Darüber hinaus stellen wir Proof-of-Principle-Daten, die die Brustkrebszelllinie BT474 verwendet wird, bestätigt ihreAbhängigkeit von Verstärkung des Faktor-Rezeptor des epidermalen Wachstums HER2 und Mutation von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat-3-Kinase (PIK3CA), wenn sie als Tumorsphäroide gewachsen. Schließlich sind wir die räumliche Wirkung dieser Abhängigkeiten Immunhistochemie weiter zu untersuchen können und bestätigen.

Sphäroid - Assays in Ultra-Low - Befestigung 96-Well - Platten bieten einen hohen Durchsatz phänotypische Beurteilung für potenzielle Onkogenizität in einem Kontext, der mehr rekapituliert leicht die physiologischen in Tumoren in vivo gefunden Bedingungen. Tatsächlich zeigten die Krebszelllinien MCF10DCIS.com und BT474 Form eng Sphäroid Strukturen (Abbildung 1A) und immunhistologische Untersuchung von Sphäroid Abschnitte unterschiedliche räumliche Veränderungen der zellulären und Kernmorphologie. Im Laufe der Zeit entwickeln einige Sphäroiden wie BT474 Sphäroiden nekrotischen Regionen, ein gemeinsames Merkmal von aggressiven soliden Tumoren (Abbildung 1B). Einige Sphäroiden entwickeln keine nekrotischen Kerne, wie die MDA-MB-231 - Zelllinie, aber in der Proliferationsmarker Ki67, die invers korreliert mit gespaltenen caspsase-3 - Expression, einem Marker der Apoptose (Abbildung 1C) Anzeige markiert Variation tun. Um festzustellen, dass mehrere Zelllinien tatsächlich recep sindtive zu BT474 siRNA-vermittelte Gen-Silencing, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 und JIMT1 Zellen wurden für sieben Tage mit siRNA Reverse-transfiziert. Das Vorhandensein von Transfektionsreagenz (mock) oder Transfektion von Steuer siRNAs hatte keinen Einfluss auf Sphäroid Lebensfähigkeit, während des essentiellen Gens Ubiquitin B (UBB) deutlich reduziert Sphäroid Lebensfähigkeit in allen getesteten Zelllinien (1D) zum Schweigen zu bringen. Wir haben eine menschliche siRNA-Bibliothek, die die am häufigsten mutierten Gene in nicht ausgewählten, ER + HER2 + und dreifach negativem Brustkrebs umfasst. Diese Bibliothek besteht aus Genen bekannter Funktion, wie MYC, PIK3CA und TP53 und diejenigen, deren Beitrag zur Karzinogenese wird nicht hergestellt. Der Bildschirm enthält auch mehrere Nicht-Targeting - Steuerung siRNAs (Control # 1, Control # 2) und siRNAs essentielle Gene Targeting, wie PLK1 und UBB, die wirken , als Kontrollen (Tabelle 1) zu töten. Wir wählten die Brust canc zu verwendener Zelllinien BT474, da sie ohne Zusatz von rekonstituierten Basalmembran leicht Sphäroide bilden, werden Arbeitspferd Zelllinien etabliert und einer bekannten genomischen Architektur aufweisen. Zum Beispiel sind BT474 - Zellen positiv für den Östrogenrezeptor (ER +), überexprimieren den humanen epidermalen Wachstumsfaktor - Rezeptor 2 (HER2 +) und Hafen Mutationen in TP53 (E285K) und PIK3CA (K111N) 13. Verwendung des Protokolls oben dargelegt, überwacht wir die Auswirkungen Gen Abreicherung auf Sphäroid Größe und Lebensfähigkeit nach sieben Tagen von siRNA Rückwärts Transfektion (1E) hatten. Interessanterweise haben die meisten Gene hat keinen signifikanten Effekt auf die Sphäroid - Bereich oder die Lebensfähigkeit (2A). Silencing von FOXO3, PIK3CA, ErbB2 und SF3B1 führte zu den bedeutendsten reproduzierbare Reduktion der Sphäroid Größe. Diese Reduktion wurde auch in Sphäroid Lebensfähigkeit nach ErbB2 und SF3B1 Silencing beobachtet. Erfreulich ist, dass wir confIRMED die Auswirkungen von PIK3CA, ErbB2 und SF3B1 Silencing auf Sphäroid Größe Hellfeldmikroskopie (2B). Wir zuvor SF3B1 als essentielles Gen in zahlreichen Zelllinie Modelle identifiziert und stellt somit siSF3B1 eine gute Tötung Kontrolle zusätzlich zu UBB 14. Interessanterweise aller Gene 200 nur das Silencing von E-Cadherin in einer signifikanten Zunahme der Lebensfähigkeit Sphäroid (2A). Untersuchung der Sphäroid Morphologie zeigten , dass E-Cadherin - Silencing in einem vollständigen Zusammenbruch der Sphäroid - Architektur geführt, mit lebenden Zellen auf dem Boden der Nieder Befestigung ruht gut (2B). Manuelle Wiederaufnahme der Untersuchung des Sphäroiden Volumen Bildschirmdaten zeigten, dass dies hatte auch beobachtet worden, hatte aber aus dem Bereich Quantifizierung eliminiert aufgrund des Objekts über den eingestellten Größenbeschränkungen zu sein. Wie bereits hervorgehoben, überexprimiert BT474 Zellen den Rezeptor-Tyrosinkinase-HER2 und beherbergen eine onkogene Mutation in<html> PIK3CA (K111N). Wir haben bestätigt , dass Silencing von ErbB2 und PIK3CA in reduzierter Sphäroid Lebensfähigkeit führte, während der Transfektion mit nicht-Targeting - Kontrollen keine Wirkung (2C) hatte. Als nächstes untersuchten wir den Einfluss von siRNA Abreicherung auf Sphäroid Histologie. BT474 Sphäroiden wurden Reverse-transfiziert mit nicht-Targeting-Kontroll-siRNA und siRNAs Targeting PIK3CA, ErbB2 und UBB. Silencing von ErbB2 und UBB führte zu einer Verringerung der pro-proliferative Markers verglichen Ki67 siRNA (2D) zu steuern. Die Aktivierung des pro-apoptotische Marker gespalten Caspase-3 erst nach UBB-Silencing beobachtet wurde, dass die Depletion von HER2 und PIK3CA was darauf hindeutet, nicht in die Apoptose führte aber waren Zytostatikum eher als zytotoxische. Tatsächlich silencing von HER2 und PIK3CA hat in der Proteinexpression der Zellzyklus-Arrest-Protein p27 in einer Erhöhung im Vergleich zu transfizierten Sphäroide steuern. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass BT474 Zellen durch onkogene HER2 und PIK3CA angetrieben signalisieren, wenn sie als 3D-Sphäroiden gewachsen Noch wichtiger ist, zeigen diese Ergebnisse, dass es möglich ist, zu. Design und eine maßgeschneiderte siRNA Screening-Bibliothek von Hunderten von Genen in Krebszelllinie Sphäroiden robust und reproduzierbar umzusetzen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig1.jpg" /> Abbildung 1: Zelllinie Optimierung für 3-dimensionale Wachstum. A. Die Brustkrebs-Zelllinien, MCF10DCIS.com und BT474 wurden in niedrigen Befestigungsplatten für 7 Tage. Hell repräsentative Bilder wurden mit einem inversen Mikroskop genommen. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. B. MCF10DCIS.com und BT474 Sphäroide wurden für 28 Tage kultiviert. 4 Tage - 100 &amp; mgr; l frisches Medium wurde alle drei wieder aufgefüllt. Sphäroide wurden in 3,8% Formaldehyd, e fixiertmBedded, geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E). Repräsentative Bilder werden bei niedrigen und hohen Vergrößerung gezeigt. Maßstabsbalken entspricht 100 &amp; mgr; m und 33 &amp; mgr; m, respectively. C. MDA-MB-231 Sphäroiden wurden für 21 Tage kultiviert. 4 Tage - 100 &amp; mgr; l frisches Medium wurde alle drei wieder aufgefüllt. Sphäroide wurden in 3,8% Formaldehyd, eingebettet, geschnitten und gefärbt mit Ki67 und gespalten Caspase-3 fixiert. Repräsentative Bilder werden angezeigt. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231, und JIMT1 Zelllinien wurden Reverse transfiziert mit mock (Transfektionsreagenz nur) und die Steuer siRNAs und UBB, ultra-low Befestigungsplatten wurden gesponnen dann Sphäroiden zu bilden. Frisches Medium (100 ul) wurde an den Tagen 1 zugegeben und 4. Nach 7 Tagen wurde die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von zwei unabhängigen biologischen dreifach durchgeführt Replikaten normalisiert # 1 zu steuern. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung eines unpa berechnetired Students t-Test (p &lt;0,05). E. Ein Flussdiagramm , das die umgekehrte Transfektionsprotokoll zusammenfassend verwendet , um funktionell Gen in Abhängigkeit Krebszelllinie Sphäroide abzufragen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54738/54738fig2.jpg" /> Abbildung 2: Functional Genomic Untersuchung von BT474 Sphäroiden Deckt Onkogene Abhängigkeiten. A. BT474 - Zellen wurden umgekehrt mit dem menschlichen siGENOME siRNA - Bibliothek 200-Gen in dreifacher Ausfertigung transfiziert. Sphäroid Größe und Lebensfähigkeit beobachtet. Rohdatenwerte waren Platte Median normalisiert und Z-Scores berechnet wurden signifikante Ausreißer zu identifizieren , größer ist als das 1,7fache der Standardabweichung der Platte Median 15. Hinweis Rand Gene ErbB2, SF3B1, PLK1 und UBB einnd E-cad. siRNAs, die signifikant erhöht oder verringert Sphäroid Bereich und Lebensfähigkeit sind in blau und rot schattiert, wo Rot die Kontrolle siRNA die abbildet. B. Die Zellen wurden Reverse - transfiziert mit nicht-Targeting - Steuerung, E-Cadherin (E-Cad), PIK3CA, ErbB2 oder UBB siRNA und dann in einem Ultra-Low - Befestigungsplatte gesponnen Sphäroiden zu bilden. Nach 7 Tagen Hellfeld Vertreter Sphäroid Bilder wurden einem inversen Mikroskop genommen werden. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. C. Die Zellen wurden Reverse - transfiziert mit nicht-Targeting - Steuerung, PIK3CA, ErbB2 oder UBB siRNA und dann in einem Ultra-Low - Befestigungsplatte gesponnen Sphäroiden zu bilden. Nach 7 Tagen wurde die Lebensfähigkeit der Zellen quantifiziert. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von zwei unabhängigen biologischen dreifach durchgeführt Replikaten normalisiert # 1 zu steuern. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung eines ungepaarten t-Test (p &lt;0,05) berechnet. D. Nach 7 Tagen wurden die Sphäroide fixiert, eingebettet, geschnitten und gefärbtfür H &amp; E, Ki67, Cleaved Caspase-3 und p27. Repräsentative Bilder werden angezeigt. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. Beachten Sie die H &amp; E der siControl Sphäroiden kleiner erscheinen aufgrund eines Artefakts der Verarbeitung und individuellen intakten Sphäroiden zur Färbung gewählt. Dies schließt jedoch nicht aus den Änderungen mit den gescannten Bildern und die Lebensfähigkeit der Zellen beobachteten Ergebnisse beeinträchtigen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54738/54738fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Non-Targeting-1 </td><td> TP53 </td><td> DST </td><td> KMT2C </td><td> Unbehandelte 1 </td><td> FCGBP </td><td> ARID1B </td><td> FBXM7 </td><td> TTC40 </td><td> Non-Targeting-2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GATA3 </td><td> TTN </td><td> MUC12 </td><td> MUC4 </td><td> Ahnak </td><td> HUWEI1 </td><td> DNAH11 </td><td> ITPR2 </td><td> ABCA13 </td><td> CREBBP </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MAP2K4 </td><td> PIK3CA </td><td> F5 </td><td> APOB </td><td> ANKRD30A </td><td> MUC17 </td><td> DNAH17 </td><td> LAMA2 </td><td> AS </td><td> CSMD2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> STARD9 </td><td> USH2A </td><td> FAT3 </td><td> LPR2 </td><td> CSMD3 </td><td> MYO18B </td><td> DNAH5 </td><td> MDN1 </td><td> ARHGAP5 </td><td> DNAH9 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CXCR3 </td><td> MUC16 </td><td> RB1 </td><td> PKHD1L1 </td><td> DNAH2 </td><td> SYNE2 </td><td> DYNC1H1 </td><td> PClo </td><td> CACNA1B </td><td> ErbB2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> SYNE1 </td><td> LYST </td><td> PTEN </td><td> SPTA1 </td><td> Unbehandelte 2 </td><td> VHL </td><td> RYR1 </td><td> COL6A3 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Non-Targeting-1 </td><td> ENAM </td><td> RYR2 </td><td> BRCA2 </td><td> Unbehandelte 1 </td><td> FMN2 </td><td> HECW1 </td><td> LAMB4 </td><td> SI </td><td> Non-Targeting-2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> FHOD3 </td><td> MACF1 </td><td> RYR3 </td><td> C2ORF16 </td><td> DMD </td><td> FRG1 </td><td> HERC2 </td><td> MYH11 </td><td> STAB1 </td><td> ZDBF2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> GOLGA6L2 </td><td> NEB </td><td> SMG1 </td><td> CACNA1E </td><td> DNA14 </td><td> GCC2 </td><td> HIVEP2 </td><td> NIPBL </td><td> TANC1 </td><td> ZNF536 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HMCN1 </td><td> NF1 </td><td> UBR5 </td><td> CACNA1F </td><td> DYNC2H1 </td><td> GON4L </td><td> HYDIN </td><td> PKD1L1 </td><td> TF </td><td> ANK3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HRNR </td><td> OBSCN </td><td> USP34 </td><td> CYMA5 </td><td> FAM208B </td><td> GPR112 </td><td> ITSN2 </td><td> RNF213 </td><td> TPR </td><td> ASPM </td><td></td></tr><tr><td></td&gt; <td> PLK1 </td><td> PCDH15 </td><td> XIRP2 </td><td> COL7A1 </td><td> FLG2 </td><td> Unbehandelte 2 </td><td> VHL </td><td> SAGE1 </td><td> UNC80 </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Non-Targeting-1 </td><td> DCHS2 </td><td> MUC5B </td><td> ZFHX4 </td><td> Unbehandelte 1 </td><td> MYO9A </td><td> SPHKAP </td><td> CXORF22 </td><td> NCOR1 </td><td> VPS13D </td><td></td></tr><tr><td></td><td&gt; ATR </td><td> DMXL2 </td><td> MXRA5 </td><td> ANK2 </td><td> KIAA1210 </td><td> PRUNE2 </td><td> TCHH </td><td> DANH6 </td><td> NOTCH2 </td><td> ANKRD12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> BIRC6 </td><td> DNAH10 </td><td> TENM1 </td><td> Geldautomat </td><td> LRP1 </td><td> SCN10A </td><td> VPS13C </td><td> DNAH7 </td><td> SPEN </td><td> C5ORF42 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CDH1 </td><td> DNAH3 </td><td> PEG3 </td><td> DIDO1 </td><td> MAP1A </td><td> SCN2A </td><td> IPTR3 </td><td> ERBB3 </td><td> SRRM2 </td><td> CCDC88A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CUBN </td><td> NOCK11 </td><td> RELN </td><td> DNAH8 </td><td> MED12 </td><td> SHROOM2 </td><td> CEP350 </td><td> FAT4 </td><td> SZT2 </td><td> CHD4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> EYS </td><td> SACS </td><td> KIAA1109 </td><td> MED13 </td><td> Unbehandelte 2 </td><td&gt; VHL </td><td> KMT2A </td><td> VPS13A </td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Non-Targeting </td><td> QSER1 </td><td> ARID1A </td><td> WDFY3 </td><td> Unbehandelte 1 </td><td> SDK1 </td><td> TEX15 </td><td> LAMA1 </td><td></td><td> Non-Targeting-2 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> COL14A1 </td><td> SHROOM3 </td><td> ATRX </td><td> EFCAB5 </td><td> SF3B1 </td><td> CBFB </td><td> AHNAK2 </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> CSMD1 </td><td> TBX3 </td><td> KIAA0947 </td><td> FOXA1 </td><td> ITPR1 </td><td> DDX3X </td><td> KIF4A </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MEFV </td><td> UBR4 </td><td> MYCBP2 </td><td> INPPL1 </td><td> FLG </td><td> HECTD4 </td><td> FAT2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MGAM </td><td> VCAN </td><td> NBEAL1 </td><td> MAP3K1 </td><td> AKAP9 </td><td> GPR98 </td><td> FOXO3 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> PLK1 </td><td> ZNF462 </td><td> SETX </td><td> NRP1 </td><td> HERC1 </td><td> Unbehandelte 2 </td><td> VHL </td><td></td><td></td><td> UBB </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Plattenlayout und Menschen siRNA Bibliothek De-Faltung. Die Tabelle enthält den Inhalt jedes der siRNA-Pools und das Layout für die niedrigen Befestigungsplatten in dem Bildschirm verwendet.

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Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.3K Aufrufe.  The Institute of Cancer Research. Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Serie: Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated cancer associated fibroblasts are a key component of the tumor stroma that interact with cancer cells and support their growth and survival. Models that recapitulate the interaction of cancer cells and activated fibroblasts are important tools for studying the stromal biology and for development of antitumor agents. Here, a method is described for the rapid generation of robust 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and activated pancreatic fibroblasts that can be used for subsequent biological studies. Additionally, described is the use of 3D spheroids in carrying out functional metabolic assays to probe cellular bioenergetics pathways using an extracellular flux analyzer paired with a spheroid microplate. Pancreatic cancer cells (Patu8902) and activated pancreatic fibroblast cells (PS1) were co-cultured and magnetized using a biocompatible nanoparticle assembly. Magnetized cells were rapidly bioprinted using magnetic drives in a 96 well format, in growth media to generate spheroids with a diameter ranging between 400-600 &#181;m within 5-7 days of culture. Functional metabolic assays using Patu8902-PS1 spheroids were then carried out using the extracellular flux technology to probe cellular energetic pathways. The method herein is simple, allows consistent generation of cancer cell-fibroblast spheroid co-cultures and can be potentially adapted to other cancer cell types upon optimization of the current described methodology.

Here, a method is described for the preparation of 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and fibroblasts, followed by measurement of metabolic functions using an extracellular flux analyzer.

Vorbereitung und metabolische Assay von 3-dimensionalen Sphäroid Ko-Kulturen von Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Forschung

Krebsforschung

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Biotechnik

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

Generierung von 3D-Tumorsphäroiden für Wirkstoffevaluierungsstudien

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Screening auf Genomebene zur Identifizierung und zum Vergleich von therapeutischen Zielen in Tumoren

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1), MPNSTs are the most common malignancy and the leading cause of death. These rare and aggressive soft-tissue sarcomas offer a stark future, with 5-year disease-free survival rates of 34-60%. Treatment options for individuals with MPNSTs are disappointingly limited, with disfiguring surgery being the foremost treatment option. Many once-promising therapies such as tipifarnib, an inhibitor of Ras signaling, have failed clinically. Likewise, phase II clinical trials with erlotinib, which targets the epidermal growth factor (EFGR), and sorafenib, which targets the vascular endothelial growth factor receptor (VEGF), platelet-derived growth factor receptor (PDGF), and Raf, in combination with standard chemotherapy, have also failed to produce a response in patients. 
In recent years, functional genomic screening methods combined with genetic profiling of cancer cell lines have proven useful for identifying essential cytoplasmic signaling pathways and the development of target-specific therapies. In the case of rare tumor types, a variation of this approach known as cross-species comparative oncogenomics is increasingly being used to identify novel therapeutic targets. In cross-species comparative oncogenomics, genetic profiling and functional genomics are performed in genetically engineered mouse (GEM) models and the results are then validated in the rare human specimens and cell lines that are available. 
This paper describes how to identify candidate driver gene mutations in human and mouse MPNST cells using whole exome sequencing (WES). We then describe how to perform genome-scale shRNA screens to identify and compare critical signaling pathways in mouse and human MPNST cells and identify druggable targets in these pathways. These methodologies provide an effective approach to identifying new therapeutic targets in a variety of human cancer types.

Autor im Rampenlicht: Suche nach neuen therapeutischen Zielen für maligne Tumore der peripheren Nervenscheide durch shRNA-Screens im Genommaßstab 

We have developed a cross-species comparative oncogenomics approach utilizing genomic analyses and functional genomic screens to identify and compare therapeutic targets in tumors arising in genetically engineered mouse models and the corresponding human tumor type.

Genetisches Profiling und Dropout-Screening im Genommaßstab zur Identifizierung therapeutischer Ziele in Mausmodellen für bösartige periphere Nervenscheidentumoren

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

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