This work has been financially supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology (No. 25248027 to M.S.).

1. Probenvorbereitung <ol><li> Reinigung von temperaturempfindlichen Monomeren <ol><li> Man löst 20 g N Isopropylacrylamid (NIPA) in 100 ml Toluol. </li><li> Filtern Sie die Lösung unter Staubabsaugung zu beseitigen. </li><li> Mischen Sie das Filtrat mit 500 ml Petrolether. </li><li> Legen Sie das Reaktionsgefäß in einem Eis-Wasser-Bad. </li><li> Rühren Sie die Lösung bis die Monomere gefällt werden (in der Regel 30 min). </li><li> Filtern Sie die Lösung unter Absaugen der ausgefällten Monomere zu erhalten. </li><li> Trocknen Sie die Monomere unter vermindertem Druck (100 Pa) über Nacht. </li></ol></li><li> Vorbereitung des temperaturempfindlichen Polymerlösung <ol><li> Entgasen 20 ml deionisiertem Wasser für 1,0 min eine Membranpumpe verwendet wird. </li><li> Man löst 780,8 mg des gereinigten NIPA in 9,5 ml entgastem und entionisiertem Wasser. </li><li> Legen Sie das Reaktionsgefäß in einem Eis-Wasser-Bad. </li><li> Schirmen Sie die Reaktion vonLicht, das durch die Vorrichtung mit Aluminiumfolie abdecken. </li><li> Rühren Sie die Lösung vorsichtig für 10 min, während eine moderate Fluss von Ar-Gas sanft über einer Pipettenspitze mit einem Rohr an der Gasflasche angebracht einzuführen. </li><li> Hinzufügen 11,9 ul N, N, N &#39;, N&#39; N&#39; - Tetramethylethylendiamin zu der Lösung über eine Mikropipette. </li><li> Rühren Sie die Lösung für 1,0 min unter Einleiten von Ar-Gas, wie es in Schritt 1.2.5 erwähnt. </li><li> Während die Probe gerührt wurde, in 0,5 ml entgastem und entionisiertem Wasser 4,0 mg Ammoniumpersulfat aufzulösen. </li><li> Mischen Sie die Probenlösung (aus Schritt 1.2.7) und Ammoniumpersulfatlösung (aus Schritt 1.2.8). </li><li> Rühren Sie die Lösung für 30 s, während Ar-Gas-Einführung, wie es in Schritt 1.2.5 erwähnt. </li><li> Decken Sie die Lösung mit Aluminiumfolie und halten es in einem Kühlschrank (4 ° C) über Nacht. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Probe Halterungen <ol><li> Platzieren 60 &amp; mgr; l der Probenlösung (vonSchritt 1.2.11) in einem Hohlraum Folie. </li><li> Decken Sie die Lösung mit einem kreisförmigen Deckglas. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu stoppen. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Lösung mit einer Mikro und Labortücher verwenden. </li><li> Verschließen Sie die Probe mit Klebstoff. Lassen Sie den Kleber trocken bei Raumtemperatur (typischerweise 6 h). </li><li> Bereiten Sie eine andere Folie mit 0,1 Gew% Polystyrol-Latex gefüllt (100-nm Partikeldurchmesser) Suspension durch folgende Schritte an 1.3.1-1.3.4. Diese Folie wird als Standard verwendet. </li></ol></li></ol> 2. Die Partikelgrößenmessung mit einem Dynamic Light Scattering Mikroskop <ol><li> Optimierung des Instruments <ol><li> Legen Sie die Polystyrol-Latex-Suspension Schieber (aus Schritt 1.3.5) auf der Bühne des inversen Mikroskops. Das Deckglas Seite sollte nach unten zeigen. </li><li> Platzieren Sie einen Strahl Dämpfer vor dem Detektor (eine Lawinenphotodiode und einen Autokorrelator). </li><li> Tragen Sie einen Laserstrahl (Festkörperlaser, λ = 488 nm, 30 mW, kontinuierlichewave) zu der Probe durch eine Objektivlinse (10 ×). Ein Teil des reflektierten Lichts geht durch einen Startspiegel des Mikroskops und wird durch eine CCD - Kamera angebracht an der Seitenöffnung des Mikroskops (1) beobachtet. </li><li> Stellen Sie die Höhe der Objektivlinse, um den Brennpunkt in der Probensuspension zu setzen, indem die Höhe der Objektivlinse von der niedrigen bis hohen Position verschieben. Während dieses Vorgangs wird das reflektierte Bild dreimal konzentriert: an der Oberfläche des Deckglases an der Grenzfläche zwischen dem Deckglas und der Probe, und an der Grenzfläche zwischen der Probe und dem Lochglasobjektträger. Stellen Sie den Brennpunkt zwischen dem zweiten und dem dritten Punkt. </li><li> Dämpft die Streulichtintensität von der Laserleistung ändert. </li><li> Einzuführen, um die Streulicht in den Detektor durch den Strahldämpfer vor dem Detektor zu entfernen. Dieses Gerät misst die zeitliche Korrelation der Lichtintensität. </li><li> Legen Sie ein Pinhole (φ = 50 &amp; mgr; m) between das Mikroskop und der Detektor die konfokale Wirkung zu erzielen. Stellen Sie die Position des Pinholes, die Lichtintensität am Detektor zu maximieren. </li><li> Messen der Zeitkorrelationsfunktion der Streulichtintensität für 30 s durch den Betrieb des Korrelators über einen Computer zu initiieren. Die gemessene Korrelationsfunktion wird oft als g (2) (t) ausgedrückt - 1, wobei t die Korrelationszeit 4 und <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq1.jpg" /> . Hier I (t) ist die Streulichtintensität zur Zeit t und (•••) T ist Zeitmittelung. Die Abklingzeit wird etwa 0,1 ms betragen. </li><li> Stellen Sie den Brennpunkt ein breites Spektrum für die anfängliche Amplitude der Zeitkorrelationsfunktion zu erhalten (g (2) (t = 0) - 1). HINWEIS: Die anfängliche Amplitude stark von der Menge des reflektierten Lichts beeinflusst wird. Durch den Brennpunkt Schlepptau bewegenard die Schnittstelle zwischen dem Deckglas und der Probe, die Menge des reflektierten Lichts zunimmt. Für starke Licht streuenden Teilchen, wie Polystyrollatex, kann die Anfangsamplitude von 0 bis 1 verändert werden, jedoch ist es schwierig, die Anfangsamplitude nahe 1 für üblichere Polymerlösungen zu setzen, weil die Intensität des reflektierten Lichts wesentlich höher ist als die des gestreuten Lichts. </li><li> Tragen Sie die inverse Laplace - Transformation (mit dem eingeschränkten Regularisierungsprogramm CONTIN 13,14) auf die Funktion erhalten zeitliche Korrelation der Größenverteilungsfunktion zu erwerben. In Fällen, in denen die anfängliche Amplitude auf weniger als 0,2 eingestellt ist, zeigt die Verteilungsfunktion des hydrodynamischen Radius eine scharfe Spitze um 100 nm, die zweimal der tatsächliche Radius ist (siehe die Diskussion für weitere Details). </li></ol></li><li> Probenmessung <ol><li> Stellen Sie die Stufe Temperatur auf 25 ° C. </li><li> Legen Sie eine Folie, hergestellt mit Poly-NIPA (PNIPA) solution (Schritt 1.3.4) auf dem Tisch des Mikroskops. </li><li> Messen Sie die Zeitkorrelationsfunktion der Intensität des gestreuten Lichts durch folgende Schritte an 2.1.4-2.1.8. Wenn die anfängliche Amplitude größer als 0,2 ist, stellen Sie den Brennpunkt der anfänglichen Amplitude der Zeitkorrelationsfunktion zu machen weniger als 0,2 für Schritt 2.1.9 folgen. Eine kleine Anfangsamplitude vereinfacht die Analyse. </li><li> Stellen Sie die Stufe Temperatur auf 35 ° C und warten, bis die Lösung trüb macht. Die untere kritische Lösungstemperatur (LCST) von PNIPA Lösung beträgt 32 ° C 15. </li><li> Messen Sie die Zeitkorrelationsfunktion durch folgende Schritte 2.1.4-2.1.8. Wenn möglich, justieren die Position des Brennpunkts der Anfangsamplitude der Zeitkorrelationsfunktion weniger als 0,2 zu machen. Für trübe Lösungen, ihre anfänglichen Amplituden neigen, da die Intensität des gestreuten Lichtes zunimmt, während der des reflektierten Lichts konstant bleibt. </li><li> Tragen Sie die inverse Laplace transformatian die Zeitkorrelation erhaltenen Funktionen die Größenverteilungsfunktionen zu erhalten. Beachten Sie, dass die tatsächliche Größe, wobei die Ausgangsamplitude kleiner als 0,2 ist die Hälfte der erhaltene Wert in Fällen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

Die anfängliche Amplitude der Zeitkorrelationsfunktion hängt stark von der Brennpunkt, wie in Abbildung 2 (a) gezeigt. Dies widerspricht scheinbar die Tatsache , dass die Lösung homogen ist ( mit Ausnahme der dünnen Schicht an der Grenzfläche) 8. Diese Variation in der Ausgangsamplitude wird in der Menge des reflektierten Lichts auf eine Veränderung zurückzuführen. Teil heterodyne Theorie 16 sagt voraus , daß die Anfangsamplitude, A, die Streulichtintensität, I s, und die reflektierte Lichtintensität I r, die folgende Gleichung erfüllen 1 <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq2.jpg" /> Diese Gleichung zeigt , daß , je größer I r wird, wird die kleinere A. Daher wird eine reduziert , indem die Fokusposition auf die Schnittstelle Schliessstellung. Die scheinbare Diffusionskonstante D A caim Falle von monodispersen Lösungen n durch Anpassung der Funktionszeitkorrelation erhalten werden: <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq3.jpg" /> woher <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq4.jpg" /> . Hierbei ist n der Brechungsindex des Lösungsmittels (Wasser, 1,33), ist θ der Streuwinkel (180 °) und λ die Wellenlänge von Licht (514,5 nm). Da wir Rückstreugeometrie angewendet wird , wird der Wert von q fixiert. Jedoch ist dieser Punkt durch die Verwendung verschiedener Wellenlängen des Lichts gelöst. Bitte beachten Sie, dass jede Art von Dauerstrichlaserquelle vorhanden ist, das DLS Mikroskop zu bauen. Dank der geringen bestrahlten Volumens, der Kohärenzfaktor 17 wird auf mehr als 0,99 sein und ist zu vernachlässigen. Für polydisperse Lösungen wird die Verteilungsfunktion von D A durch die inverse Laplace - Transformation erhalten. Teilüberlagerungs thEory sagt auch voraus , dass D A nicht die gleiche wie die tatsächliche Diffusionskonstante D ist. Diese beiden Diffusionskonstanten die folgende Gleichung erfüllen: <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq5.jpg" /> Die konstante Diffusion D wird in den hydrodynamischen Radius R h umgewandelt , um die Einstein-Stokes - Gleichung 4. Wenn A = 1, wird diese Beziehung D A = D. In diesem Fall ist das Datenumwandlungsverfahren das gleiche wie das für die gemeinsame dynamische Lichtstreuung. Die rote Linie in Figur 2 (b) gezeigt , entspricht diesem Fall. Im Gegensatz dazu wird diese Beziehung D A = 0,5 D an der Grenze der A → 0. Daher wird die Größe geschätzt doppelt so groß wie die tatsächliche Größe zu sein , wenn A klein ist (praktisch weniger als 0,2), wie durch die gezeigte blaue Linie von 2 (b) </strong&gt;. Wenn wir wissen , dass eine signifikant klein ist, kann die horizontale Achse verschoben werden, wie in 2 (c) gezeigt. Im Prinzip können wir D A in D für jeden Wert von A zu konvertieren. In der Praxis ist es jedoch besser , die Anfangsamplitude kleiner als 0,2 eingestellt, da die einfache Näherung D A ~ 0,5 D gilt. Die herausragenden Merkmale der dynamischen Lichtstreuung Technik Mikroskop wurden unter Verwendung einer PNIPA Lösung unter Beweis gestellt. Die Konformation von PNIPA unterhalb und oberhalb der LCST wurde 15,18 Neutronenkleinwinkel mit intensiv untersucht Streuung. Im Gegensatz dazu dynamischer Lichtstreuung wurde für die Analyse von PNIPA oberhalb der LCST verwendet wegen seiner Trübung 19 nicht. Dieses Problem wird durch das dynamische Lichtstreuungsmikroskop gelöst, wie in den 3 (a) und (b) gezeigt. Die Größe dieser Aggregate ist mehrere &amp;# 181; m, die durch entweder Kleinwinkelröntgen / Neutronenstreuung oder herkömmlichen Lichtstreuungsverfahren nicht erhalten werden kann. Zeitaufgelöste Messungen mit diesem System geben Informationen über den Aggregationsprozess während der Temperaturänderung. Der Nachteil der dynamischen Streuung Mikroskoplicht wird auch in Figur 3 veranschaulicht. Für das Ergebnis unterhalb der LCST wird die Zeitkorrelationsfunktion durch die sehr kleine Menge an Staub vorhanden ist (die schwarzen Linien in 3) stark beeinflusst. Beispielsweise zerfallen die Zeitkorrelationsfunktion nicht vollständig, auch bei Korrelationszeiten in der Größenordnung von 1,0 s. Dies ist, weil das Volumen mit dieser Vorrichtung bestrahlt (ungefähr 1,0 &amp; mgr; m) deutlich kleiner als die bestrahlt mit der üblichen dynamischen Lichtstreuungsvorrichtung (ca. 100 um). In Fällen, in denen die Intensität des gestreuten Lichtes zu schwach ist, wird das Signal durch das Rauschen verdeckt, wie die durch s verursachtMall Mengen an Staub in der Lösung. Daher sind die drei Spitzen in Abbildung 3 (b) gezeigt haben , kann nicht quantitative Bedeutung , obwohl die allgemeine Ordnung der Größe von Bedeutung ist. Man beachte, dass solch eine schwache Streuer kann durch ein herkömmliches dynamisches Lichtstreuungsvorrichtung gemessen werden. Wir haben gezeigt, dass die dynamische Lichtstreuung Mikroskop ermöglicht es uns, sowohl transparente als auch trübe Proben mit dem gleichen Setup zu messen. Da die optische Weglänge in den Proben kurz ist, kann diese Technik zu stark lichtabsorbierenden Proben angewendet werden, wie beispielsweise Kohlenstoff - Nanoröhrchen - Suspensionen 20. Darüber hinaus aufgrund der hohen räumlichen Auflösung kann diese Technik auf biologische Zellen aufgebracht werden. Für ihre Anwendung in der Biologie kann dieses Verfahren auch mit anderen bildgebenden Verfahren, wie Fluoreszenz und Raman-Bildgebung kombiniert werden. So glauben wir, dass die dynamische Lichtstreuung Mikroskop ein leistungsfähiges Werkzeug für ein breites Spektrum von Forschungsfeldern ist.

Particle size is one of the most fundamental properties of colloidal and polymer solutions. Numerous techniques are used to measure the particle size. Particle sizes of 1.0 &#181;m or larger can be measured directly using an optical microscope. For smaller particles, alternative techniques, such as laser diffraction, electron microscopy, or atomic force microscopy, are used2,3. Dynamic light scattering is a commonly-used technique for the measurement of particle size distributions in solutions4. The results obtained using this technique are not derived from images of the particles but from the characteristic time of the fluctuations in scattered light intensity. These fluctuations originate from Brownian motion, which is characterized by a diffusion constant. The size distribution is obtained from the distribution of diffusion constants using the Einstein-Stokes equation. Due to its simplicity, dynamic light scattering is widely used for the routine assessment of solutions, such as paints and food colloids.
Pretreatment is required for most of the techniques used for the particle size measurement of solution samples. In the case of electron microscopy and atomic force microscopy, the sample must be analyzed under vacuum conditions. Therefore, it is difficult to observe the samples in their native forms. Furthermore, for laser diffraction and dynamic light scattering, only diluted samples that are free from multiple scattering and light absorption can be measured. To overcome this difficulty, several new techniques have been proposed for the measurement of dynamic light scattering from undiluted, concentrated solutions, such as cross-correlation spectroscopy5,6, low-coherence dynamic light scattering7,8, diffusing-wave spectroscopy9,10, and differential dynamic microscopy11,12.
We have developed a new apparatus called a dynamic light scattering microscope1. This apparatus enables us to measure turbid samples without dilution by means of a confocal optical system in which multiple scattering is eliminated using a pinhole. However, the measurement procedure and data analysis are slightly more complicated than those of commercially-available instruments. This video explains the measurement procedure and data analysis in detail using the analysis of the temperature-responsive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), as an example.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-isopropylacrylamide, 98%</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>I0401</td><td></td></tr><tr><td>toluene, 99%</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>201-01876</td><td></td></tr><tr><td>petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 &amp;deg;C</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-22565</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetramethylethylenediamine, 99%</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate, 98%</td><td>Sigma</td><td>248614</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene latex suspension, 1 wt%</td><td>Duke Scientific Corporation</td><td>3500A</td><td></td></tr><tr><td>argon</td><td>Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.</td><td></td><td>purity &gt; 99.999 vol.%</td></tr><tr><td>cavity slide</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>83-0336</td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td>Nikon Instech Co., Ltd.</td><td>ECLIPSE Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate</td><td>Tokai Hit CO.,Ltd</td><td>TP-108R-C</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS 488LX</td><td></td></tr><tr><td>avalanche photodiode</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode</td><td></td></tr><tr><td>correlator</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-5000/EPP</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

Zeitkorrelationsfunktion der Streulichtintensität für eine Polystyrol - Latexsuspension (Partikelradius: 50 nm) wurden bei verschiedenen Brennpunkten gemessen, wie in 2 (a) gezeigt. Diese Korrelationsfunktionen wurden in die Verteilungs umgewandelt Funktionen des hydrodynamischen Radius durch die inverse Laplace - Transformation (siehe Figur 2 (b) und (c)). Nach dem gleichen Verfahren werden die Zeitkorrelationsfunktionen und Verteilungsfunktionen des hydrodynamischen Radius der PNIPA Lösung wurden bei 25 ° C und 35 ° C erhalten wurden. Figuren 3 (a) und (b) zeigen die Zeitkorrelationsfunktion der Streulichtintensität und die entsprechenden Funktionen Verteilungs Größe der PNIPA Lösung unterhalb (25 ° C) und höher (35 ° C) der LCST. Die Größenverteilungsfunktionen wurden durch die inverse Laplace-Transformation durch die gefolgt erhaltenKorrektur des Teil heterodyne. Die durchschnittliche hydrodynamischen Radius unterhalb der LCST ist mehrere zehn Nanometer, die für die Polymerlösungen typisch ist. Im Gegensatz dazu ist der hydrodynamische Radius oberhalb der LCST etwa 1,0 &amp; mgr; m. Dieses Ergebnis ist konsistent mit der Tatsache, dass die Lösung über die LCST trüb wird. Die roten und blauen Linien in Abbildung 3 für die Größenverteilung der PNIPA Lösungen erhalten sofort nach und 20 Minuten nach der Lösung wurde trübe sind. Figur 3 (b) zeigt deutlich das Wachstum der Aggregation. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schema der dynamischen Lichtstreuung Mikroskop. Pinhole (PH), Strahlteiler (BS), einen Polarisator (Pol) und Avalanche-Photodiode (APD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig1large.jpg" target="_blank">um</a>eine größere Version dieser Figur. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für einen Polystyrol - Latex - Suspension. (A) Zeitkorrelationsfunktion der Streulichtintensität für die Polystyrol - Latex - Suspension. Der Nennradius beträgt 50 nm und die Konzentration von 0,1 Gew%. Zwei Datensätze wurden aus verschiedenen Streupunkte erhalten. (B), (c) entsprechende Größe Verteilungsfunktionen für die Polystyrol - Latex - Suspension , erhalten durch die inverse Laplace - Transformation von (a). Die rote Linie entspricht der Zeitkorrelationsfunktion, dessen Anfangsamplitude beträgt etwa 1,0, und die blaue Linie entspricht, die mit einer Anfangsamplitude, die etwa 0,2 ist. Die horizontale Achse berechnet wurde ohne (b) und (c) unter Berücksichtigung der Wirkung des partiellen Überlagerung (PHD), wenn A &lt;&lt;<html> ; 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse für eine PNIPA Lösung. (A) Zeitkorrelationsfunktionen von Streulichtintensität für die PNIPA Lösung. (B) Entsprechende Größenverteilungsfunktionen für die PNIPA Lösung durch die inverse Laplace - Transformation von (a) erhalten. Die horizontale Achse wurde berechnet, um die Wirkung von Teillagerung für jeden Datensatz unter Berücksichtigung. Die schwarze Linie stellt die bei 25 ° C erhaltenen Daten. Die rote Linie gibt die erhaltenen Daten nur nachdem die Lösung trübe gedreht (35 ° C). Die blaue Linie stellt die erhaltenen Daten nach einer 20-minütigen Messung der roten Linie./54885/54885fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Ein Protokoll für die direkte Messung der Partikelgrößenverteilung in konzentrierten Lösungen dynamische Lichtstreuung Mikroskopie dargestellt.

Die Messung der Partikelgrößenverteilung in trüber Lösungen durch Dynamic Light Scattering Mikroskopie

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

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14.3K Aufrufe.  University of Tokyo.  Ein Protokoll für die direkte Messung der Partikelgrößenverteilung in konzentrierten Lösungen dynamische Lichtstreuung Mikroskopie dargestellt. 

Serie: Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Forschung

Biotechnik

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

Dispersion von Nanomaterialien in wässrigen Medien: zur Protokoll-Optimierung

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Umwelt

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this work, we use single particle tracking of fluorescently labeled PNIPAM microgels as a showcase for tuning microgel size by a rapid non-stirred precipitation polymerization procedure. This approach is well suited for prototyping new reaction compositions and conditions or for applications that do not require large amounts of product. Microgel synthesis, particle size and structure determination by dynamic and static light scattering are detailed in the protocol. It is shown that the addition of functional comonomers can have a large influence on the particle nucleation and structure. Single particle tracking by wide-field fluorescence microscopy allows for an investigation of the diffusion of labeled tracer microgels in a concentrated matrix of non-labeled microgels, a system not easily investigated by other methods such as dynamic light scattering.

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform PolyN-isopropylacrylamide Microgels

Non-stirred precipitation polymerization provides a rapid, reproducible prototyping approach to the synthesis of stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) microgels of narrow size distribution. In this protocol synthesis, light scattering characterization and single particle fluorescence tracking of these microgels in a wide-field microscopy setup are demonstrated.

Kontrollierte Synthese und Fluoreszenz-Tracking von Hoch Uniform Poly (<em&gt; N</em&gt; Isopropylacrylamid) Mikrogele

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this ...

Chemie

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

DNA-Magnetpartikel verbindlich Analyse durch dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

Anwendung von Spannung in der dynamischen Lichtstreuung Partikelgrößenanalyse

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful platform for exploring the physics of polyelectrolyte interactions and also offer a promising solution to the pressing problem of delivering therapeutic oligonucleotides in vivo. Developing predictive structure-property relationships for PCMs has proven difficult, in part due to the presence of strong kinetic traps during nanoparticle self-assembly. This article discusses criteria for choosing polymers for PCM construction and provides protocols based on salt annealing that enable assembly of repeatable, low-polydispersity nanoparticles. We also discuss PCM characterization using light scattering, small-angle X-ray scattering, and electron microscopy.

We provide protocols and representative data for designing, assembling, and characterizing polyelectrolyte complex micelles, core-shell nanoparticles formed by polyelectrolytes and hydrophilic charged-uncharged block copolymers.

Montage und Charakterisierung von Polyelektrolyt-Komplexmizellen

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood banks. Cells fragment off microparticles (MP) when they are stressed. Blood and blood components may contain cellular fragments from a variety of cells, most notably from activated platelets. When performing their roles as innate immune cells and major players in coagulation and hemostasis, platelets change shape and generate microparticles. With dynamic light scattering (DLS)-based microparticle detection, it is possible to differentiate activated (high microparticle) from non-activated (low microparticle) platelets in transfusions, and optimize the use of this scarce blood product. Previous research suggests that providing non-activated platelets for prophylactic use in hematology-oncology patients could reduce their risk of becoming refractory and improve patient care. The goal of this screening method is to routinely differentiate activated from non-activated platelets. The method described here outlines the steps to be performed for routine platelet inventory management in a hospital blood bank: obtaining a sample from a platelet transfusion, loading the sample into the capillary for DLS measurement, performing the DLS test to identify microparticles, and using the reported microparticle content to identify activated platelets.

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative in hospital blood banks. The goal is to differentiate activated from non-activated platelets to optimize the use of platelets. Providing non-activated platelets to hematology-oncology patients might reduce their high risk to become refractory.

Routine-Screening Methode für Mikropartikel in Thrombozytentransfusionen

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Medizin

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal biopolymers may lead to a host of active and adaptable materials. However, engineering such materials with precisely tuned properties requires measuring how the dynamics depend on the network composition and synthesis methods. Quantifying such dynamics is challenged by variations across the time, space, and formulation space of composite networks. The protocol here describes how the Fourier analysis technique, differential dynamic microscopy (DDM), can quantify the dynamics of biopolymer networks and is particularly well suited for studies of cytoskeleton networks. DDM works on time sequences of images acquired using a range of microscopy modalities, including laser-scanning confocal, widefield fluorescence, and brightfield imaging. From such image sequences, one can extract characteristic decorrelation times of density fluctuations across a span of wave vectors. A user-friendly, open-source Python package to perform DDM analysis is also developed. With this package, one can measure the dynamics of labeled cytoskeleton components or of embedded tracer particles, as demonstrated here with data of intermediate filament (vimentin) networks and active actin-microtubule networks. Users with no prior programming or image processing experience will be able to perform DDM using this software package and associated documentation.

Differential dynamic microscopy (DDM) combines features of dynamic light scattering and microscopy. Here, the process of using DDM to characterize reconstituted cytoskeleton networks by quantifying the subdiffusive and caged dynamics of particles in vimentin networks and the ballistic motion of active myosin-driven actin-microtubule composites is presented.

Quantifizierung der Zytoskelettdynamik mittels differentieller dynamischer Mikroskopie

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Biologie

Dynamic Light Scattering Analysis for the Determination of the Particle Size of Iron-Carbohydrate Complexes

Intravenously administered iron-carbohydrate nanoparticle complexes are widely used to treat iron deficiency. This class includes several structurally heterogeneous nanoparticle complexes, which exhibit varying sensitivity to the conditions required for the methodologies available to physicochemically characterize these agents. Currently, the critical quality attributes of iron-carbohydrate complexes have not been fully established. Dynamic light scattering (DLS) has emerged as a fundamental method to determine intact particle size and distribution. However, challenges still remain regarding the standardization of methodologies across laboratories, specific modifications required for individual iron-carbohydrate products, and how the size distribution can be best described. Importantly, the diluent and serial dilutions used must be standardized. The wide variance in approaches for sample preparation and data reporting limit the use of DLS for the comparison of iron-carbohydrate agents. Herein, we detail a robust and easily reproducible protocol to measure the size and size distribution of the iron-carbohydrate complex, iron sucrose, using the Z-average and polydispersity index.

Dynamic light scattering (DLS) has emerged as a suitable assay for evaluating the particle size and distribution of intravenously administered iron-carbohydrate complexes. However, the protocols lack standardization and need to be modified for each iron-carbohydrate complex analyzed. The present protocol describes the application and special considerations for the analysis of iron sucrose.

Dynamische Lichtstreuanalyse zur Bestimmung der Partikelgröße von Eisen-Kohlenhydrat-Komplexen

Intravenously administered iron-carbohydrate nanoparticle complexes are widely used to treat iron deficiency. This class includes several structurally ...

Die Messung der Partikelgrößenverteilung in trüber Lösungen durch Dynamic Light Scattering Mikroskopie

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