In erster Linie bedanken wir uns herzlich bei den Müttern, die an diesem Projekt teilgenommen haben. Als nächstes erkennen wir alle Mitarbeiter an, die das Probenahmeverfahren, den Anästhesisten, den Krankenschwester Anästhesisten und die chirurgischen Krankenschwestern unterstützt und erleichtert haben. Das Projekt wäre nicht möglich gewesen, ohne von der Südost-Norwegen-Regionalen Gesundheitsbehörde und der norwegischen Beratungsstelle für Frauengesundheit, Oslo-Universität und der lokalen Finanzierung des Universitätsklinikums Oslo zu finanzieren.

Die Studie wurde von den Datenschutzbeauftragten am Universitätsklinikum Oslo und dem Regionalkomitee für Medizinische und Gesundheitsforschung Ethik, Südnorwegen 2419/2011, genehmigt. Alle Teilnehmer unterschrieben eine schriftliche Einverständniserklärung. 1. Vorbereitungen HINWEIS: Eine Zeitleiste für die Prozeduren ist in Abbildung 1 dargestellt . <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig1.jpg" /> Abbildung 1 : Flussdiagramm Beschreiben des Timings und des Personals, das in der 4-Gefäß-Stichprobenverfahren involviert ist. Eine Farbe repräsentiert eine Person. Detaillierte Beschreibung der Methode ist im Protokoll angegeben. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55847/55847fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Personal <ol><lI&gt; Stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Mitarbeiter zur Verfügung stehen: ein hochqualifizierter Fetalmedizin-Spezialist, der die Ultraschallmessungen durchführt, zwei Geburtshelfer, die die Chirurgie durchführen, einer der Geburtshelfer und zwei Krankenschwestern, die die Proben sammeln, ein Assistent, der die Blutgasanalysen und einen Assistenten verarbeitet Andere Proben nacheinander und unmittelbar nach der Sammlung. ANMERKUNG: Im Falle einer fortgeschritteneren Sammlung von Plazenta-Gewebe ist eine zusätzliche Person erforderlich. </li></ol></li><li> Ausrüstung <ol><li> Vorbereitung der Ausrüstung, 50 ml eiskalte 1 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 25 ml kalte RNA-stabilisierende Lösung und 5 x 0,5 ml der optimalen Schneidtemperatur-Verbindung (OCT). Etikettieren Sie die Vacutainer und Röhren. Siehe vorläufige Liste der Ausrüstung. </li></ol></li></ol> 2. Mütterliche Merkmale <ol><li> Notieren Sie die mütterlichen klinischen und nicht-klinischen Merkmale bei der Aufnahme und wiederholen Sie relevante Fragen und michAsurements, einschließlich Gewicht, zum Zeitpunkt der Lieferung. Notieren Sie die Dauer der Fastenzeit vor dem Kaiserschnitt und alle blutdrucksenkenden Episoden, die während der Operation auftreten. Anmerkung: Fügen Sie den minimalen mütterlichen klinischen Datensatz in einer aktuellen Veröffentlichung von Global Pregnancy CoLaboratory (COLAB) gemeldet. Dieser Artikel enthält auch einige sehr wichtige Aspekte bei der Auswahl der Studienpopulationen und sollte bei der Planung der Studie 18 angesprochen werden. </li><li> Betrachten Sie die Aufzeichnung von väterlichen Merkmalen, einschließlich Ethnizität, Alter und Body Mass Index (BMI). </li></ol> 3. Ultraschall <ol><li> Führen Sie die Doppler-Ultraschalluntersuchung am Tag der Auslieferung durch, mit den Frauen im Fastenzustand. Führen Sie die Untersuchung während einer Periode der fetalen Ruhe, mit der Frau in semi-Rückenlage Position, etwas seitlich gegenüber der Region von Interesse gekippt, um Kompression der Aorta und Hohlvene zu vermeiden. Überwachen Sie den Ausgang inTensität durch die mechanischen und thermischen Indizes auf dem Display. </li><li> Nabelschnur <ol><li> Manifestiere die Nabelvene in einer sagittalen oder schrägen Transektion des fötalen Abdomens. Messen Sie den inneren Gefäßdurchmesser im geraden Teil der intraabdominalen Nabelvene, bevor Sie sichtbare Zweige haben. Verwenden Sie den regulären B-Modus und visualisieren Sie das Gefäß in einem senkrechten Insonationswinkel für Durchmessermessungen und halten Sie mehrere optimale Rahmen für spätere Messungen, um die Wirkung von Änderungen des pulsierenden Durchmessers zu minimieren. <ol><li> Wiederholen Sie die Messungen fünf bis zehn mal 19 . </li></ol></li><li> Am selben Ort verwenden Sie Doppler-Ultraschall und stellen Sie die Sonde so ein, dass sie einen möglichst geringen Insonationswinkel (immer &lt;30 °) erhält, um die zeitlich gemittelte maximale Geschwindigkeit (TAMX) zu messen. Erhalten Sie die Geschwindigkeit über einen Zeitraum von 3 - 5 s (nicht pulsierende Strömung). </li></ol></li><li> Uterine Arterie <ol><li> Doppler benutzenUltraschall, um die Gebärmutterarterie zu visualisieren, während sie die äußere Iliakalarterie kreuzt, unmittelbar nachdem sie von der A. iliaca interna verzweigt. Stellen Sie die Sonde an dieser Stelle ein, um einen niedrigen Isolationswinkel (immer &lt;30 °) zu erhalten und TAMX zu messen. Erhalten Sie die Geschwindigkeit als die mittlere Geschwindigkeit von drei Herzzyklen. </li><li> Da es unwahrscheinlich ist, dass ein senkrechter Winkel an der gleichen Stelle wie TAMX gemessen wird, folgen Sie dem Gefäß distal, um einen korrekten Winkel für Durchmessermessungen zu erhalten, so nah wie möglich an den Stellen der Durchmessermessungen als erreichbar. Die Durchmessermessungen ausschließen, wenn sichtbare Gefäße vor dieser Stelle abzweigen, ausgewertet durch Farb-Doppler-Ultraschall. <ol><li> Verwenden Sie den regulären B-Modus und visualisieren Sie das Gefäß in einem senkrechten Insonationswinkel für Durchmessermessungen und halten Sie mehrere optimale Rahmen für spätere Messungen, um die Wirkung von Änderungen des pulsierenden Durchmessers zu minimieren. </li><li> Wiederholen Sie die Messungen fünf bis zehn mal 19 . </li></ol></<html> Li&gt; </ol></li><li> Beachten Sie die Position der Plazenta. </li></ol> 4. 4-Gefäß Blutentnahme ANMERKUNG: Die Zeitleiste für die Prozeduren ist in Abbildung 1 dargestellt und ein Überblick über die Proben ist in Abbildung 2 dargestellt . <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig2.jpg" /> Abbildung 2 : Schematische Darstellung der Placental Vasculature und der Sampling Sites. Bei der 4-Gefäß-Probenahme werden Blutproben aus der Uterusvene, der Radialarterie (als Proxy für die Uterusarterie) und den Nabelarterien und Vene gezogen. Blutfluss in der Uterusarterie und der Nabelvene wird durch Ultraschall gemessen. Gewebeproben aus der Plazenta werden gesammelt. Abbildung: Øystein H. Horgmo, Universität Oslo.5847fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol><li> Sicherheitsmassnahmen <ol><li> Geben Sie alle Mitarbeiter im Operationssaal mit Handschuhen, chirurgischen Scrub-Anzügen, Masken und Kopfbedeckungen. </li><li> Stellen Sie den Chirurgen und Forschungspersonal in Kontakt mit dem Operationsfeld mit chirurgischen Scrub-Anzügen, Masken, Kopfbedeckungen, Kleidern und Doppelhandschuhen. Gläser sind optional. </li><li> Stellen Sie das Personal zur Handhabung der Blutproben mit Handschuhen bei. </li><li> Stellen Sie das Personal zur Handhabung der Placenta-Proben mit Handschuhen und chirurgischen Masken zur Verfügung. Die Homogenisierung erfordert die Verwendung von Hauben. </li></ol></li><li> Vorbereitung im Operationssaal <ol><li> Geben Sie ein Briefing und Hand die Ausrüstung für alle Mitarbeiter, die die Probenahme vor Beginn der Operation zu unterstützen. </li><li> Ansprache der Anästhesisten und Anästhesiologie Krankenschwester, die mit dem notwendigen peripheren arteriellen und venösen Zugang zu unterstützen, und sicherzustellen, dassWährend der Probenahme werden keine Flüssigkeiten intravenös verabreicht. </li><li> Geben Sie drei Spritzen (10 ml) ohne Nadeln an die Person, die mit der antecubitalen Aderprobe und zwei Spritzen (eine 20 ml und eine 10 ml) und eine Blutgasspritze (mit Heparin) an die Person unterstützt, die mit der radialen Arterie hilft. </li><li> Bereiten Sie zwei sterile Spritzen (20 ml), fünf sterile Spritzen (10 ml), drei &quot;Schmetterlingsnadeln&quot; und zwei Blutgasspritzen für das Operationsfeld vor. </li></ol></li><li> Zugang zu Blutgefäßen. <ol><li> Befolgen Sie das Standardverfahren vor dem Kaiserschnitt, um den peripheren intravenösen (iv) Zugang zu gewährleisten. HINWEIS: Die antecubitale Vene ist vorzuziehen, weil es einfacher ist, Proben von dieser Seite zu ziehen. </li><li> Lokalisieren Sie die radiale Arterie am Handgelenk durch Ultraschall oder durch Palpation. Nach 0,5 mL subkutaner Lidocain-Analgesie, legen Sie eine arterielle Linie in die radiale Arterie. Verlassen Sie die Probenahme von dieser Seite im Falle von drei fehlgeschlagenen Einfügungen, oderWenn die Frau während der Insertion Schmerzen erlebt. HINWEIS: Führen Sie den chirurgischen Eingriff des Kaiserschnittes nach Standardverfahren durch. Im Folgenden werden nur die für das Stichprobenverfahren erforderlichen Anpassungen unterstrichen. </li></ol></li><li> Mütterliche Blutproben HINWEIS: Erhält alle drei mütterlichen Blutproben (Uterusvene, Radialarterie und Antecubitalvene) gleichzeitig vor dem Uterusschnitt. <ol><li> Für die Uterusvene, nach dem Öffnen der Bauchhöhle, verwenden Sie einen Retraktor, um die Bauchwand zu heben und die Hauptäste der Uterusvenen auf den anterolateralen Seiten des Uterus freizulegen. Erhalten Sie Blut von Uterusvenen Zweige auf der gleichen Seite wie die Plazenta, wann immer möglich oder verwenden Sie die prominentesten Vene Plexus, wenn die Plazenta befindet sich in der uterinen Mittellinie. <ol><li> Legen Sie eine Schmetterlingsnadel auf eine Blutgas-Spritze in der Uterusvene in einem Winkel von etwa 30 Grad und sammeln Sie Blut durch sanfte Aspiration zu vermeidenHämolyse Bei sorgfältiger Sicherung der iv-Position der Schmetterlingsnadel die gefüllte Blutgasspritze durch eine 20 mL und eine 10 mL Spritze nacheinander ersetzen. HINWEIS: Der optimale Zugang ist am besten auf der kontralateralen Seite der gewählten Uterusvene gewährleistet. </li></ol></li><li> Für die radiale Arterie, aspirieren aus der intra-arteriellen Linie. Die ersten 5 ml verwerfen und dann 3 ml in der Heparinspritze für Blutgasanalysen aspirieren, gefolgt von 3 ml in zwei Spritzen (20 + 10 ml). </li><li> Für die antecubitale Vene, saugt sanft aus dem intravenösen Katheter. Die ersten 5 ml verwerfen und dann 30 ml in drei Spritzen (10 ml) absaugen. </li><li> Führen Sie eine endgültige Inspektion der Probenahmestelle auf der Uterusvene durch, bevor Sie beginnen, den Bauch zu schließen. </li></ol></li><li> Fetale Blutproben <ol><li> Wenn das Kind geboren wird, sofort Aspiration von Blut aus der Nabelarterie, ohne die Nabelschnur zu klemmen oder die Plazenta zu liefern. Start WitzH die Spritze für die Blutgasanalyse, und folgen mit drei 10 ml Spritzen, wenn möglich. </li><li> Wenn die Arterienproben gesichert sind, klemmen Sie die Schnur und geben Sie das Kind an die Hebamme vor der Probenahme aus der Nabelvene (Blutgas und 20 + 10 ml Spritzen). HINWEIS: Erhalten Sie alle Nabelproben innerhalb von Sekunden nach Lieferung und mit der Plazenta in situ, es sei denn, es hat sich spontan abgetrennt. </li><li> Befolgen Sie die norwegischen Empfehlungen zum späten Schnurklemmen. Im Falle eines verzweifelten Kindes, klemme und schneide die Schnur sofort und die Hand das Kind an die Hebamme und Neonatologen. </li></ol></li><li> Umgang mit Blutproben <ol><li> Setzen Sie die Blutgasspritzen auf Eis, während Sie den Rest der Blutproben vorbereiten und analysieren sie in einem Blutgasanalysator innerhalb von 5 min. </li><li> Übertragen Sie die Blutproben sofort auf Vacutainer und legen Sie die Plasmaschläuche 1 - 2 min auf eine Wippe, bevor Sie sie auf Eis legen. Lassen Sie die Serumröhrchen auf die ArbeitStuhlbank für 30 Minuten zu begleichen. HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt in der Prozedur, die zusätzliche Aufmerksamkeit benötigt, da Proben von allen fünf Standorten gleichzeitig vorbereitet werden müssen, um eine gute Qualität zu gewährleisten. </li><li> Die Plasmaproben so schnell wie möglich zentrifugieren und innerhalb von 30 min bei 6 ° C, 2500 xg für 20 min. </li><li> Nach 30 min zentrifugieren die Serumproben bei Raumtemperatur für 10 min bei 2.500 x g. </li><li> Aliquot die Überstände sorgfältig auf 2 ml Kryoröhrchen, wobei 0,5 ml des Überstandes über dem Pellet zurückbleiben, um plättchenfreies Plasma zu gewährleisten. </li><li> Die Proben bei -80 ° C aufbewahren. </li></ol></li></ol> 5. Sammlung von Placental Tissue <ol><li> Legen Sie die Plazenta-Wohnung so schnell wie möglich auf ein Eis gekühltes Sektionsfach, nachdem es geliefert worden ist. Fotografieren und messen den längsten Durchmesser und den Durchmesser bei 90 Grad. </li><li> Wiegen Sie die Plazenta. </li><li> Notieren Sie das Gewicht, die beiden Durchmesser, jeder gRoss Pathologie, Anzahl der Gefäße in der Schnur und das Zeitintervall von der Anlieferung an, wenn die Plazenta auf Eis gelegt wurde. HINWEIS: Sende die Plazenta zur pathologischen Untersuchung, wenn klinisch angegeben. </li><li> Legen Sie die Plazenta mit der mütterlichen Oberfläche nach oben und identifizieren Sie 4 - 5 Probenahmestellen zufällig in jedem Quadranten der Plazenta, Vermeidung von Bereichen der offenen Pathologie. Entfernen Sie die Decidua mit einer Schere, um 3 - 5 mm von der mütterlichen Oberfläche wegzuschneiden. Sammeln Sie ein 1 - 2 cm 3 Stück Zottengewebe von jedem Standort. </li><li> Das gesammelte Gewebe vorsichtig in 50 ml kaltem 1M PBS waschen. Teilen Sie in mehrere Stücke von jeder Probenahmestelle und aliquot. Hinweis: Die Größe der Plazenta-Stücke hängt von den geplanten Analysen ab. </li><li> Fügen Sie Aliquots von 0,1 - 0,5 cm 3 Gewebeproben zu 5 Kryoröhren hinzu und schnappen Sie sich in flüssigem Stickstoff ein. </li><li> Füge kleine Stücke von 0,1 - 0,2 cm 3 zu dem Röhrchen mit 25 ml RNA-Stabilisierungslösung hinzu. Bei 4 lagern6, C für 24 h, verwerfen die RNA-Stabilisierungslösung und ersetzen sie. Einfrieren. </li><li> Füge Stücke von 0,5 cm 3 zu den 5 Kryoröhrchen mit 0,5 mL OCT hinzu, oben mit OCT auffüllen, mischen und einfrieren. </li><li> Die Proben bei -80 ° C bis zur Analyse aufbewahren. HINWEIS: Burton et al. Bietet einen hervorragenden Überblick über die praktischen Aspekte der Plazenta-Probenahme in Abhängigkeit von den geplanten Analysen. 20 Man empfiehlt, das übrige Gewebe zur Isolierung der mikrovillösen und basalen Membranen vorzubereiten und deziduales Gewebe durch Vakuumsaugtechnik zu sammeln. 21 , 22 </li></ol> 6. Neonatale Eigenschaften <ol><li> Notieren Sie die neonatalen Eigenschaften, einschließlich Apgar-Score (1, 5 und 10 min), Geschlecht, Gewicht, Länge, Gestationsalter und Zulassung zur Neugeborenen Intensivstation (Länge und Ergebnis des Aufenthalts). </li><li> Betrachten Sie die Messung der neonatalen Körperzusammensetzung durch anthropometrische Messungen, Luft-VerschiebenPlethysmographen oder Dual-Röntgen-Absorptiometrie. 23 , 24 </li></ol> 7. Berechnungen <ol><li> Nehmen wir eine ähnliche Blutzusammensetzung in der Radial- und Uterusarterie an und berechnen die uteroplazentäre arteriovenöse Konzentrationsdifferenz. Uteroplazentale arteriovenöse Konzentrationsdifferenz = C A - C V Umbilische venöse - arterielle Konzentrationsdifferenz = C v - C a Wo C die Konzentration mit den Indizes ist: A, die radiale Arterie; V, die Uterusvene; V die Nabelvene und a, die Nabelarterie. </li><li> Berechnen Sie den Volumen Blutfluss, mL / min (Q): <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/55847/55847eq1.jpg" /> Wenn D der Gefäßdurchmesser (cm) ist, ist TAMX die zeitlich gemittelte maximale Geschwindigkeit und h ist der Koeffizient für das räumliche Blutgeschwindigkeitsprofil. Verwenden Sie 0,5 als Koeffizient für die Nabelvene und0,6 für die Uterusarterie 25 , 26 . </li><li> Berechnen Sie die Plazenta-Aufnahme und Freigabe nach Ficks Prinzip: Uteroplazentale Aufnahme = ( C A - C V ) x Qm Fetale Aufnahme = ( C v - C a ) X Q f Subscripts: m, mütterlich und f, fetal. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Die Plazenta-4-Gefäß-Probenahme-Methode ist für drei Hauptzwecke relevant. Zuerst kann man daran denken, wie spezifische Substanzen von der Plazenta auf der mütterlichen Seite aufgenommen und möglicherweise auf die Nabelzirkulation und den Fötus übertragen werden, wie unsere Glukose- und Aminosäure-Studien zeigen. Zweitens ist die Methode sehr relevant für die Untersuchung von Stoffen, die von der Plazenta produziert und in die mütterlichen oder fetalen Zirkulationen freigesetzt werden, wie die Progester...

Nach den National Institutes of Health, USA, ist die Plazenta das am wenigsten verstandene Organ im menschlichen Körper 1 , 2 , 3 . Es ist schwierig, die menschliche Plazenta in vivo zugänglich zu machen und zu studieren, ohne die fortdauernde Schwangerschaft unethisch zu riskieren. Studien der Plazenta-Funktion im Menschen sind daher weitgehend auf In-vitro- und Ex-vivo- Modellen basiert. Die Mehrheit der bisherigen in vivo Studien des Plazententransports und des Stoffwechsels wurden bei den Tieren 4 , 5 , 6 durchgeführt . Da jedoch die Plazenta-Struktur und die Funktionen zwischen den Arten stark variieren, muss die Extrapolation der Ergebnisse von Tieren auf den Menschen mit Vorsicht erfolgen. Nur wenige kleinere menschliche in vivo Studien haben plazentale und fetale Aufnahme und Transport unter normalen physiologischen untersuchtAl-Bedingungen, und keiner hat die integrierte Übertragung mehrerer Verbindungen 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 untersucht . Diese grundlegenden Studien zeigen, dass in vivo Studien der menschlichen Plazenta machbar sind und dass sie mehrere Zwecke dienen können. Zuerst können aktuelle Konzepte von Plazenta-Funktionen, die hauptsächlich aus in vitro , ex vivo und Tierstudien abgeleitet sind, in einer menschlichen Umgebung getestet werden und so einen neuen und spezifischeren Einblick in die menschliche Plazenta liefern. Zweitens können die Eigenschaften der dysfunktionellen Plazenta, die mit einem abweichenden fetalen Wachstum, Präeklampsie, mütterlichem Diabetes, metabolischem Syndrom und anderen mütterlichen Stoffwechselstörungen assoziiert sind, besser charakterisiert werden. Drittens bieten menschliche In-vivo- Studien die Möglichkeit, Diagnosen zu entwickelnTic und prädiktive Werkzeuge der Plazenta-Funktion. Vor diesem Hintergrund wollten wir eine umfassende Sammlung physiologischer Daten erstellen, um die menschliche Plazenta-Funktion in vivo zu untersuchen . Während eines geplanten Kaiserschnittes nutzen wir den intraabdominellen Zugang zur Uterusvene, um Blutproben aus den ankommenden und ausgehenden Gefäßen auf den mütterlichen und fötalen Seiten der Plazenta (die 4-Gefäß-Probenahme-Methode) zu sammeln. Diese Proben werden verwendet , um die paarige arteriovenöse Konzentrationsunterschiede von Nährstoffen zu berechnen und anderen Substanzen 14. Darüber hinaus messen wir den Volumenblutfluss auf beiden Seiten der Plazenta durch Ultraschall. Folglich kann eine Plazenta- und fetale Aufnahme einer beliebigen Verbindung quantifiziert werden. Ferner ist es möglich, von der Plazenta freigesetzte Stoffe zu den mütterlichen und fetalen Zirkulationen 15 , 16 , 17 zu bestimmen. Beim KombinierenD mit klinischen Parametern von Mutter und Kind und Analysen von Plazenta und anderen relevanten Geweben hat diese Methode das spannende Potenzial, viele Aspekte von Plazenta-Funktionen in vivo in denselben Mutter-Fötus-Paaren zu integrieren.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Maternal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impedance scale</td><td>Tanita</td><td></td><td>or similar</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ultrasound measurements&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequoia 512 ultrasound machine</td><td>Acuson</td><td></td><td>equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Blood samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arerial cannula</td><td>BD Medical</td><td>682245</td><td>or similar</td></tr><tr><td>20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-20ES</td><td>or similar. 3 needed.</td></tr><tr><td>10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-10ES</td><td>or similar. 9 needed.</td></tr><tr><td>5 cc 6% Luer Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-05S1</td><td>or similar. 2 needed.</td></tr><tr><td>Arterial blood gas syringe&amp;nbsp;</td><td>Radiometer Medical</td><td></td><td>or similar. 4 needed.</td></tr><tr><td>Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450081</td><td>(intended for single use).3 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL EDTA&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456043</td><td>or similar. Label with sample site. 10 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456305</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456089</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 3 mL&amp;nbsp; 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454334</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed.</td></tr><tr><td>Marked trays to transport the syringes</td><td></td><td></td><td>to transport the blood samples in the operation theatre</td></tr><tr><td>Rocker</td><td></td><td></td><td>for gentle mixing of the samples</td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Placenta samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal tray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal ruler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>or similar. Dilute 10 M to&amp;nbsp; 1 M before use</td></tr><tr><td>RNA stabilization solution</td><td>Sigma</td><td>R0901-500ML&amp;nbsp;</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td><td>vwr</td><td>361603E</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed.</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227,285</td><td>or similar. Label with &quot;RNA later&quot;, sample site and ID. 2 needed.</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fetal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Measuring tape</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the 4-vessel sampling approach to integrative studies of human placental physiology in vivo

Die menschliche Plazenta ist für die Forschung sehr unzugänglich, während sie sich noch in utero befindet . Das gegenwärtige Verständnis der menschlichen Plazenta-Physiologie in vivo beruht daher weitgehend auf Tierversuchen, trotz der hohen Vielfalt der Arten in der Plazenta-Anatomie, der Hämodynamik und der Dauer der Schwangerschaft. Die überwiegende Mehrheit der menschlichen Plazenta-Studien sind Ex-vivo- Perfusions-Studien oder in vitro- Trophoblasten-Studien. Obwohl in vitro Studien und Tiermodelle wesentlich sind, ist die Extrapolation der Ergebnisse aus solchen Studien auf die menschliche Plazenta in vivo ungewiss. Wir zielten darauf ab, die menschliche Plazenta-Physiologie in vivo zu behandeln und ein detailliertes Protokoll der Methode vorzustellen. Durch die Ausnutzung des intraabdominellen Zugangs zur Uterusvene kurz vor dem Uterusschnitt während des geplanten Kaiserschnittes sammeln wir Blutproben aus den ankommenden und ausgehenden Schiffen auf der mütterlichen und fötalen Seite der Plazenta. Bei der Kombination von conKonzentrationsmessungen von Blutproben mit Volumen Blutflussmessungen, sind wir in der Lage, Plazenta und fetale Aufnahme und Freisetzung einer Verbindung zu quantifizieren. Darüber hinaus können Plazenta-Gewebeproben aus denselben Mutter-Fötus-Paaren Messungen der Transporterdichte und -aktivität und anderer Aspekte von Plazenta-Funktionen in vivo liefern. Durch diese integrative Nutzung der 4-Gefäß-Probenahme-Methode sind wir in der Lage, einige der aktuellen Konzepte der Plazenta Nährstofftransfer und Metabolismus in vivo , sowohl in normalen und pathologischen Schwangerschaften zu testen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Identifizierung von Substanzen, die von der Plazenta auf die mütterliche Zirkulation abgesondert werden, was ein wichtiger Beitrag zur Suche nach Biomarkern der Plazenta-Dysfunktion sein könnte.

Die 4-Gefäß-Probenahme-Methode ist in der klinischen Praxis anwendbar und wir haben erfolgreich Blutproben von 209 Mutter / Kleinkindern erhalten. In 128 von diesen haben wir auch erreicht, um Volumen Blutfluss zu messen. Komplette 4-Gefäß-Probenahme und gute Qualitäts-Durchflussmessungen von mütterlichen und fetalen Gefäßen wurden in 70 Mutter-Fötus-Paaren ( Abbildung 3 ) erhalten. Darüber hinaus haben wir bisher Blut und Plazenta Proben von 30 pr...

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The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

Wir präsentieren eine detaillierte Methode, um die menschliche Plazenta-Physiologie in vivo zu studieren. Die Methode kombiniert die Blutentnahme von den ankommenden und ausgehenden Gefäßen auf der mütterlichen und fötalen Seite der Plazenta mit Ultraschallmessungen von Volumen Blutfluss und Plazenta Gewebe Probenahme.

Der 4-Gefäß-Stichprobenansatz für integrative Studien der menschlichen Plazenta-Physiologie<em&gt; In vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

the-4-vessel-sampling-approach-to-integrative-studies-human-placental

Research

JoVE Journal

Medicine

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

10.5K Aufrufe.  Oslo University Hospital.  Wir präsentieren eine detaillierte Methode, um die menschliche Plazenta-Physiologie in vivo zu studieren. Die Methode kombiniert die Blutentnahme von den ankommenden und ausgehenden Gefäßen auf der mütterlichen und fötalen Seite der Plazenta mit Ultraschallmessungen von Volumen Blutfluss und Plazenta Gewebe Probenahme. 

Serie: The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC twin pregnancies develop complications arising from the shared placenta and associated vascular connections1. Severe twin-to-twin syndrome (TTTS) is reported to account for approximately 20% of these complications2,3. Inter-twin vascular connections occur in almost all MC placentas and are related to the prognosis and outcome of these high-risk twin pregnancies. The number, size and type of connections have been implicated in the development of TTTS and other MC twin conditions. Three types of inter-twin vascular connections occur: 1) artery to vein connections (AVs) in which a branch artery carrying deoxygenated blood from one twin courses along the fetal surface of the placenta and dives into a placental cotyledon. Blood flows via a deep intraparenchymal capillary network into a draining vein that emerges at the fetal surface of the placenta and brings oxygenated blood toward the other twin. There is unidirectional flow from the twin supplying the afferent artery toward the twin receiving the efferent vein; 2) artery to artery connections (AAs) in which a branch artery from each twin meets directly on the superficial placental surface resulting in a vessel with pulsatile bidirectional flow, and 3) vein to vein connections (VVs) in which a branch vein from each twin meets directly on the superficial placental surface allowing low pressure bidirectional flow. In utero obstetric sonography with targeted Doppler interrogation has been used to identify the presence of AV and AA connections4. Prenatally detected AAs that have been confirmed by postnatal placental injection studies have been shown to be associated with an improved prognosis for both twins5. Furthermore, fetoscopic laser ablation of inter-twin vascular connections on the fetal surface of the shared placenta is now the preferred treatment for early, severe TTTS. 
Postnatal placental injection studies provide a valuable method to confirm the accuracy of prenatal Doppler ultrasound findings and the efficacy of fetal laser therapy6. Using colored dyes separately hand-injected into the arterial and venous circulations of each twin, the technique highlights and delineates AVs, AAs, and VVs. This definitive demonstration of MC placental vascular anatomy may then be correlated with Doppler ultrasound findings and neonatal outcome to enhance our understanding of the pathophysiology of MC twinning and its sequelae. Here we demonstrate our placental injection technique.

Vascular mapping of monochorionic (MC) twin placentas after birth provides a means for detailed demonstration of vascular connections between the twins&#x2019; circulations. 
Imbalance of these connections is thought to play a pivotal role in the development of complications of MC twinning including twin-to-twin transfusion syndrome.

Führungsdraht Assisted Katheterisierung und Farbstoff Injection for Vascular Mapping von Monochoriale Twin Plazenten

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

Forschung

Medizin

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biologie

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Biotechnik

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Entwicklungsbiologie

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Ex Vivo Perfusion der Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Immunologie und Infektion

Verbesserung der ex vivo Plazenta-Explantatkultur mit einem flussbasierten Ansatz

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models inadequately reflect the dynamic in utero setting, where the placenta encounters constant slight shear stress due to plasma or blood flow. To address this limitation, a flow culture system has been devised to bring ex vivo placental explant cultivation closer to the in utero flow conditions experienced within the maternal body. Within this approach, placental explants are cultivated in a sequence of five interconnected flow chambers. This setting&#160;maintains physiological oxygen concentrations and a consistent flow rate. The collected data reveals that under flow conditions, the preservation of tissue morphology exhibits notable enhancement compared to conventional static methods. This innovative technique introduces a straightforward means of ex vivo placental explant culture, offering a more faithful representation of the dynamic in vivo environment. Moreover, this study introduces new&#160;possibilities for investigating the functional dynamics of the feto-maternal interface. By embracing feasible dynamic methodologies, a deeper comprehension of placental biology is facilitated, underscoring its relevance for maternal-fetal health.

Autor im Rampenlicht: Vorantreiben der Forschung durch Einzelzellsequenzierung und räumliche Histologie in Plazentageweben 

Here is a protocol for culturing placental explants under constant flow conditions. This approach enhances traditional static villous culture systems by enabling the replication of dynamic physiological environments.

Der 4-Gefäß-Stichprobenansatz für integrative Studien der menschlichen Plazenta-Physiologie

Zusammenfassung

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