Name: rapid in vivo assessment of adjuvant's cytotoxic t lymphocytes generation capabilities for vaccine development
Uploaded: 2018-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
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Wir sind verpflichtet, unseren technischen Assistenten: U. Bröder und H. Shkarlet, die uns während der experimentellen Verfahren geholfen. Diese Arbeit wurde teilweise von EU-Zuschüssen (UniVax, Vertrag Nr. 601738 und TRANSVAC2, Vertrag Nr. 730964) und ein Stipendium der Helmholtz-Gemeinschaft (HAI-IDR) finanziert. Die Finanzierungsquellen hat keinen Einfluss auf die Forschung design, Erzeugung von Manuskript oder Entscheidung, zur Veröffentlichung übermitteln.

Alle Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden aus dem C57BL/6-Hintergrund. Alle Tiere wurden unter Pathogen-freies Bedingungen gehalten. Alle Experimente wurden nach den normativen das deutsche Tierschutzgesetz (TierSchG BGBl. durchgeführt. ICH S 1105; 25.05.1998) und des unteren Sachsen-Ausschusses für die Ethik von Tierversuchen und das Landesamt (untere Sachsen Stand für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit), unter der Genehmigung Nr. 33,4-42502-04-13/1281 und 162280 angenommen wurden.
1. CFSE-Färbung des OT-I T-Zellen und Adoptiv-Transfer
Hinweis: OT-ich Mäuse sind Transgen generierten Tiere, die einen T-Zell-Rezeptor (TCR) Ausdrücken mit festen α und β-Ketten, die zusammen die Immuno-Dominant-Peptid der OVA, erkennen SIINFEKL10,11. Infolgedessen haben diese Mäuse eine deutlich hohe Anzahl von SIINFEKL-spezifische CD8+ T-Zellen (97 %)12 im Vergleich zu normalen oder OVA geimpften Mäuse (≤ 1 %)13.
<ol><li>Isolierung von nachvollziehbar CD8+ T-Zellen von OT-ich Mäuse mit dem Ausdruck T-Lymphozyten-spezifischen Thy1ein (Thy1.1) Allel:<ol>
<li>Einschläfern 6-9 Wochen alten OT-ich Mäuse durch CO2 Inhalation gefolgt von zervikale Dislokation14. Die Milz und große Lymphknoten (leisten-, axillären und zervikalen Paare nur) indem die Haut mit chirurgische Scheren, ablösen der Haut aus dem Körper mit Hilfe von chirurgischen Zangen und Pinzetten zu sezieren und legen Sie sie in Petrischalen (60 x 15 mm) jeweils ein 100 µm Pore Netz Tasse Gewebe Schleifen und Zelle Freilassung.</li>
		<li>Pflegen Sie Petrischalen (jeweils mit einem Mesh-Cup) in 3-5 mL des kompletten RPMI Medium (RPMI 1640, 10 % V/V FCS, 100 U/mL Penicillin, Streptomycin 50 µg/mL) auf Eis gehalten.</li>
		<li>Pürieren Sie die Organe mit Hilfe von einem Spritzenkolben oder ein ähnliches steriles Instrument (vorherige schneiden ist nicht erforderlich) und sammeln Sie die entstandene Suspension Einzelzelle in 15 mL Zentrifuge Röhren.</li>
		<li>Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Waschen Sie die Zellen in 10 mL kaltem PBS durch Zentrifugation und lyse der Erythrozyten aus der Milz wieder aussetzen das Pellet in 1 mL/Milz Ammoniumchlorid Puffers (ACK-Puffer, im Handel erhältlich). Brüten Sie die Zellen für 1,5 min auf Eis, und waschen Sie anschließend die Zellen mit 10 mL kaltem PBS durch Zentrifugieren (wie zuvor).</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie das Pellet in das gleiche Rohr in 1 mL PBS (pH 7,2) mit 5 % fötalen Rinderserum für magnetische Isolierung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um magnetische Isolierung durchzuführen, gehen Sie zu der negativen Auslese der CD8+ T-Zellen durch die Verwendung eines magnetischen isolierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers oder Protokolle15veröffentlicht.</li>
	<li>Zur Durchführung CFSE-Färbung, zuerst die Anzahl der CD8+ T Zellen gewonnenen OT-ich Mäuse mit einem automatisierten Zelle Zähler (Partikelzähler). Fleck 1-5 x 107 Zellen/mL in ein Volumen von 1-5 mL mit 5 µM CFSE mit PBS-Puffer für 7 min bei 37 ° C, lichtgeschützt in einem 15 ml Falcon-Röhrchen.</li>
	<li>Stillen Sie die CFSE-Färbung der Zellen das gleiche Volumen (1:1) des fötalen Rinderserum hinzufügen zu, und inkubieren sie zusätzliche 7 min bei 37 ° C, vor Licht geschützt. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL PBS zweimal.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler. Festlegen der Zellzahl auf 3-5 x 107 Zellen/mL PBS um 3-5 x 106 Zellen/Maus in 100 µL intravenös zu injizieren (i.v.) über die Rute Vene.</li>
	<li>Zum Heck Vene Injektionen durchführen zu immobilisieren die Mäuse in entsprechenden wachstumsbefürworter. Wärmen Sie den Rückenbereich und Tail der Mäuse injiziert werden, mithilfe einer Rotlicht-Lampe, zwischen 20 bis 25 cm entfernt von den Mäusen für 1-3 min zum Heck Vene Vasodilatation zu ermöglichen. Hinweis: Dadurch Leichtigkeit Vene Erkennung und Verwaltung der Zellsuspension.</li>
	<li>(Mit der Hand zwischen die Mäuse und die Lampe platziert) sicherzustellen, dass es nicht zu heiß für die Mäuse und wenn die Rute Venen deutlich sichtbar sind, fahren Sie mit der Injektion. Injizieren Sie die Zellen in der seitlichen oder dorsalen Schweif Ader mit einer 1mL Spritze mit einem 25-Gauge-Nadel16.</li>
</ol>2. Immunisierung (Endo-freie OVA +/-adjuvante)
<ol><li>Legen Sie die Mäuse transplantiert mit OT-ich Zellen (Schritt 1.7, Abbildung 1) in einer Narkose-Kammer und Isofluran in Sauerstoff durch eine Anästhesie Maschine14zu verwalten.</li>
	<li>Wenn die Maus völlig eingeschlafen unter Narkose ist, nehmen Sie es aus der Kammer und rasieren Sie das Fell der Maus auf den Bereich über den Gluteus Superficialis (seitlichen unteren Rücken) mithilfe einer elektrischen Haar Beschneidemaschine, um eine saubere Injektion durchführen mit einen guten Blick auf das Einsatzgebiet.</li>
	<li>50 µL des Impfstoffes, s.c. in den rasierten Bereich mit einer 25-Gauge-Nadel zu injizieren.</li>
</ol>3. Isolation von Lymphozyten und Färbung für Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Isolierung von Lymphozyten und splenocyten<ol>
<li>Einschläfern Sie die geimpften Mäuse durch CO2 Einatmen, gefolgt von zervikale Dislokation.</li>
		<li>Extrahieren Sie der Entwässerung und entfernten Lymphknoten und der Milz und legen Sie sie in separaten Petrischalen mit 100 µm Pore Netz Tassen Gewebe Schleifen und Zelle Freilassung. Führen Sie die Schritte 1.1.2 durch 1.1.3.</li>
		<li>Abgießen Sie den überstand nach Zentrifugation und wieder auszusetzen Sie, die Zelle Pellets in das gleiche Volumen der Überrest PBS (ca. 100 µL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Färbung für Flow-zytometrie-Analyse<ol>
<li>In einem 15 mL Zentrifugenröhrchen bereiten Sie einen master-Mix enthält die Färbung Antikörper in den Konzentrationen, die in Tabelle 1dargestellt, ein 2 X so nachgiebig Färbung Mischung konzentriert. Bereiten Sie genügend Volumen des master-Mix, 100 µL pro Probe zu haben. Die Zellen und die master-Mix 1:1 mischen und bei 4° C für 30 min inkubieren. Hinweis: Der letzte Färbung Band pro Probe sollte 200 µL (100 µL der Zelle Pellet + 100 µL Antikörper-master-Mix).</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugation, wie unter 1.1.3, Hinzufügen von 10 mL PBS, zweimal.</li>
		<li>Wieder aussetzen der gefärbten Zellen in 0,5-1 mL PBS für Erwerb und die Übertragung der Aussetzung zu Flow Cytometer Röhren. Immer die Proben auf Eis und vor Licht geschützt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. die Durchflusszytometrie
<ol><li>Immer Vorfilter die Zellproben mit 70-100 µm filtern.</li>
	<li>Die Fluorophore detailliert in Tabelle 1 (Perlen oder Zellen) bereiten Sie einheitliche Färbung Entschädigung Kontrollen vor. Hinweis: Entschädigung sollte durchgeführt im Cytometer oder Analyse-Software17,18,19 und auf alle Proben angewendet werden.</li>
	<li>Folgen Sie der gating-Strategie in Abbildung 2dargestellt. Kurz, Tor Populationen im forward Scatter Höhe vs. forward Scatter Bereich (Abbildung 2A), und wieder Seite streuen breit vs. Scatter Seitenbereich (SSA, Abb. 2 b), um Dubletten auszuschließen.</li>
	<li>Tor der Bevölkerung aus Figur 2 b durch Plotten BV 650 (Auto-Fluoreszenz) vs. FITC (CFSE) um echte CFSE-zu diskriminieren gefärbten Zellen aus hohen Auto-fluoreszierende Zellen. Enthalten Sie Perlen oder Zellen befleckt mit Antikörper konjugiert BV 650 in Entschädigung Steuerelemente. Dieses Grundstück (Abbildung 2) BV 650 vs. FITC wird verwendet, um die OT Tor-ich CFSE gefärbten Zellen.</li>
	<li>Tor der Bevölkerung aus Figur 2 C für Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs. APC (CD8) um Zellen aus Spender vs. Empfänger Mäusen zu unterscheiden. Hinweis: Zellen abgeleitet von OT-ich Spender Mäuse sind Thy1.1+ (CD90.1), WT (C57BL/6, Empfänger) Mäuse-abgeleitete Zellen Thy1.2+ (CD90.2) (Abb. 2D). Einige Labore haben OT-ich Mäuse in einem Thy1.2 Hintergrund und WT (C57BL/6) in einem Thy1.1. In diesem Fall müssen Sie einen Antikörper gegen Thy1.2 für OT verwenden-ich Handy-gating.</li>
	<li>Re Tor CD8+ Zellen von Thy1.1+ Bevölkerung durch Plotten es auf ein Tor, bestehend aus BV 450 (CD4) vs. APC (CD8) (Abb. 2E).</li>
	<li>Anzeigen die Bevölkerung in Abbildung 2E mithilfe eine Histogrammanzeige von der CD8 gated+ Zellen zeigen CFSE (FITC, 530/15-Kanal - blaue Laser-), Tor die proliferierte Bevölkerung durch die Einbeziehung der Intensitäten von 102 bis auf die Ebene wo die ungeteilten Kontrolle Bevölkerungen sind (Intensitäten ~ 105, abhängig von der Wirksamkeit der CFSE-Färbung und die Spannungseinstellung auf das Durchflusszytometer) (Abb. 2F).</li>
	<li>Machen Sie einen zusätzliches Tor (nicht in Abbildung 2 dargestellt) Plotten FITC vs. L/D-Marker (450/20 Kanal, UV-Laser), um tote Zellen parallel zur Verbreitung Bewertung bewerten.</li>
	<li>Erwerben Sie mindestens 5000 Ereignisse für die Entschädigung Steuerelemente und 10,000 Ereignisse (Tor E, Abbildung 2) aus den Proben in einem Durchflusszytometer. Laufen die Cytometer mit geringer oder mittlerer Durchfluss (Flussraten von 20.000 Veranstaltungen/s nicht überschreiten).</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Moderne Impfstoffe sind im Idealfall Composedof gereinigte Antigen und Hilfsstoffe, mit den möglichen Zusatz eines Liefersysteme wie Liposomen, virusähnliche Partikel, Nanopartikel oder live Vektoren. Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung eines Impfstoffes ist, die richtigen adjuvanten nach den klinischen Bedürfnissen wählen. Bestandteil des Lieferumfangs könnte begünstigt eine humorale vs. zelluläre Immunantwort (oder beides), die Wahl eines lokalen vs. einer systemischen Immunantwort (oder beides) und die Art...

Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzieren Impfstoffe sind wichtige therapeutische Interventionen, die entwickelt wurden, um bestimmte Arten von Krebs1zu kämpfen. CTL sind auch wichtig für prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger2. Darüber hinaus CTL sind eine der wenigen immun Abwehrmechanismen in Gefahr Bevölkerungen wie Neugeborene3,4 wen auch abhängig von CTL gegen frühen Lebens Infektionen5funktionell aktiv. In diesem Zusammenhang führte Impfstoffe gegen Respiratory Syncytial Virus (RSV), die mit Adjuvans entwickelt wurden, die nicht CTL-Antworten (Alaun) entlocken wird ein Totalausfall des Impfstoffes führt zu schwerwiegenden Komplikationen bei Infektionen bei Säuglingen6. Diese negativen Auswirkungen der Impfung können rückgängig gemacht werden, indem eine CD8+ T-Zell Antwort7. Wir haben bereits gezeigt, dass die wichtigsten Zytokine (Typ-I-Interferone) hervorgerufen durch einige Stimulator der Interferon-Genen (STING)-Agonisten unerlässlich für die CTL-Antworten generiert durch diese Adjuvantien8, teilweise sind durch die Messung der Verbreitung von OT-I T-Zellen nach Impfung und anhand dieser Ergebnisse als ein Maß für die CTL induzierende Fähigkeiten beobachtet Impfung Zeitpläne9erweitert. Die Messung der Verbreitung von OT-ich CD8+ T-Zellen in einem Wild-Typ (WT) C57BL/6 Empfänger Maus durch Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Farbstoff Verdünnung ist eine robuste Einschätzung der Fähigkeit des Adjuvans eines Impfstoffs zu generieren Kreuz-Grundierung von SIINFEKL, (die Immuno-dominante Peptid von Ovalbumin, Eizellen). Variationen dieser Technik sind weit verbreitet für die Beurteilung der Verbreitung von OT-ich CD8+ und OT-II CD4+ T Zellen. Zum Beispiel hat es in Abwesenheit des ausgewählten Zytokine (KO-Mäusen) oder impfstoffwirksamkeit nach Antigen-Rückruf bei WT Tieren Messen eingesetzt. Wir entwickelten ein kurzes Protokoll (4 Tage-Experiment) in dem nach Passive Übertragung der CFSE--gefärbten OT-ich CD8+ T-Zellen, eine subkutane (s.c.)-Immunisierung, bestehend aus einer Dosis von 50 µg von Endotoxin-freie OVA ergänzt mit Test Adjuvantien verabreicht (Abbildung 1). Die Follow-up der Ergebnisse 48 h nach der Impfung bietet zuverlässigen Beweis für die Fähigkeit des Adjuvans, CTL-Antworten zu generieren. Mit dieser Strategie ist es möglich, die Wirksamkeit der lokalen Immunantwort in die drainierenden Lymphknoten nach Immunisierung sowie das Ausmaß der Reaktion zu bewerten, durch Messung der CTL-Aktivität in der Milz (oder entfernte Lymphknoten).

<table><tbody><tr><td>BD LSR Fortessa Cell Analyzer</td><td>BD</td><td>Special Order</td><td>Flow Cytometer</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes</td><td>C34554</td><td>Proliferation Dye</td></tr><tr><td>MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td>Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td><td>Molecular Probes</td><td>L23105</td><td>Dead Cell Marker</td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-0900-82</td><td>antibody</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD8a Antibody</td><td>BioLegend</td><td>100712</td><td>antibody</td></tr><tr><td>BV421 Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>740007</td><td>antibody</td></tr><tr><td>Z2 coulter Particle count and Size Analyzer</td><td>Beckman Coulter</td><td>9914591DA</td><td>Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter</td></tr><tr><td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td><td>Hyglos(Germany)</td><td>321000</td><td>Ovalbumin endotoxin free tested.</td></tr><tr><td>Cell Strainer 100&amp;micro;m nylon</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Cell strainer (100 &amp;micro;m pore mesh cups).</td></tr><tr><td>Sample Vials</td><td>Beckman Coulter</td><td>899366014</td><td>Sample vials for Z2 automated counter</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice (CD90.2)</td><td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td><td></td><td>Company is now Envigo</td></tr><tr><td>OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)</td><td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td><td></td><td>Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo</td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Fischer (Corning)</td><td>14-959-5</td><td>Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL tubes</td><td>Fischer (Corning)</td><td>05-527-90</td><td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td></tr><tr><td>PBS (500 mL)</td><td>Fischer (Gibco)</td><td>20-012-027</td><td>Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2</td></tr><tr><td>Red lamp (heating lamp)</td><td>Dirk Rossmann GmbH (Germany)</td><td>405096</td><td>Heating infrred lamp (100 wats)</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane)</td><td>Abbott Laboratories (USA)</td><td>5260.04-05.</td><td>Isoflurane anesthesic (250 mL flask).</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber&lt;/strong&gt;</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td>Isoflurane anesthesia machine.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>11-875-093</td><td>Base medium with Glutamine (500 mL)</td></tr><tr><td>Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>15-140-148</td><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td></tr><tr><td>Fetal Bobine Serum (Gibco)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>10082147</td><td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer (100 ml)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>A1049201</td><td>Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also</td></tr><tr><td>Plastic Petri Dishes</td><td>Nunc (distributed by ThermoFischer)</td><td>150340</td><td>60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated</td></tr><tr><td>Cell Clump Filter</td><td>CellTrics (Sysmex)</td><td>04-004-2317</td><td>CellTrics&amp;reg; 50 &amp;mu;m, sterile</td></tr></tbody></table>

rapid in vivo assessment of adjuvant's cytotoxic t lymphocytes generation capabilities for vaccine development

Die Bewertung der modernen Untereinheit Impfstoffe zeigt, dass die Generation von neutralisierenden Antikörpern wichtig, aber nicht ausreichend für die adjuvante Auswahl. Daher sind Hilfsstoffe mit humorale und zelluläre Immuno-stimulierende Funktionen, die in der Lage, zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Antworten zu fördern sind dringend notwendig. So steht treu Überwachung der adjuvanten Kandidaten, die Kreuz-Grundierung zu induzieren und anschließend verbessern CTL-Generation einen entscheidenden Schritt in der Entwicklung von Impfstoffen. Hier präsentieren wir einen Antrag auf eine Methode, die SIINFEKL-spezifische verwendet (OT-ich) T-Zellen, die Kreuz-Präsentation des Modells Antigen Ovalbumin (OVA) in Vivo in Anwesenheit von verschiedenen adjuvante Kandidaten zu überwachen. Diese Methode stellt ein Schnelltest Adjuvantien mit den besten Cross-Priming-Funktionen auswählen. Die Proliferation von CD8+ T Zellen ist die wertvollste Angabe des Kreuz-Grundierung und es gilt auch als Korrelat des Adjuvans-induzierte Kreuz-Präsentation. Diese Funktion kann in verschiedenen immun Organen wie Lymphknoten und Milz ausgewertet werden. Das Ausmaß der CTL-Generation auch überwacht werden kann, wodurch es Erkenntnisse über die Natur eines einheimischen (Lymphknoten vor allem entleeren) oder eine systemische Reaktion (entfernte Lymphknoten und/oder Milz). Diese Technik weiter erlaubt mehrere Modifikationen zum Testen Medikamente, die können hemmen bestimmte Wege Kreuz-Präsentation und bietet auch die Möglichkeit in verschiedene Stämme von konventionellen und gentechnisch veränderten Mäusen verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen wird die Anwendung, die wir hier präsentieren nützlich für Impfstoff-Labors in Industrie oder Wissenschaft sein, entwickeln oder ändern chemischen Hilfsstoffe für Impfstoff-Forschung und Entwicklung.

Um die Behandlungen mit einer anderen Kombination von Adjuvantien (ADJ1 und ADJ2) zu testen, beurteilten wir die CTL-Erzeugungskapazitäten durch Messung der Verbreitung von adoptively übertragenen OT-ich CD8+ T-Zellen durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2). Hierzu gebeizt wir zuvor isolierte Zellen aus der drainierenden Lymphknoten und der Milz (Tabelle 1). Durch die Messung der Proliferation von CD8+ T Zellen in Lym...

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Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

8.6K Aufrufe.  Helmholtz Centre for Infection Research. Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.

Serie: Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Forschung

Immunologie und Infektion

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten<em&gt; In-vivo-</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we investigated immunological effects of a novel lipid-DNA immunostimulant in nanoparticle form from different administration routes in the mouse: oral, intranasal, subcutaneous, footpad, intraperitoneal, and intravenous. These injections will directly influence the immune response, and harvesting lymphatic tissues and analysis of dendritic cell (DC) activation in the tissues are crucial parts of these evaluations. The extraction of mediastinal lymph nodes (mLNs) is important but quite complex because of the size and location of this organ. A stepwise procedure for harvesting the inguinal lymph node (iLN), mLN, and spleen and analyzing DC activation by flow cytometry is described.

Experimental procedures for the subsequent extraction of lymphatic tissues to test lymphoid dendritic cell activation are described after treatment of an immunostimulating nanomaterial.

Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; in particular, some MHC I-restricted epitopes can induce effective cytotoxic T lymphocyte activity to clear tumor cells. Additionally, nasal administration is an effective and safe delivery technique for tumor vaccines due to its convenience and improved patient compliance. However, epitope peptides are unsuitable for nasal delivery because of their poor immunogenicity and lack of delivery efficiency. Nanoemulsions (NEs) are thermodynamically stable systems that can be loaded with antigens and delivered directly to the nasal mucosal surface. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) is the core pentapeptide of laminin, an integrin-binding peptide expressed by human respiratory epithelial cells. In this study, an intranasal self-assembled epitope peptide NE tumor vaccine containing the synthetic peptide IKVAV-OVA257-264 (I-OVA) was prepared by a low-energy emulsification method. The combination of IKVAV and OVA257-264 can enhance antigen uptake by nasal mucosal epithelial cells. Here, we establish a protocol to study the physicochemical characteristics by transmission electron microscopy (TEM), atomic force microscopy (AFM), and dynamic light scattering (DLS); stability in the presence of mucin protein; toxicity by examining the cell viability of BEAS-2B cells and the nasal and lung tissues of C57BL/6 mice; cellular uptake by confocal laser scanning microscopy (CLSM); release profiles by imaging small animals in vivo; and the protective and therapeutic effect of the vaccine by using an E.G7 tumor-bearing model. We anticipate that the protocol will provide technical and theoretical clues for the future development of novel T cell epitope peptide mucosal vaccines.

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Here, we present detailed methods for the preparation and evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo.

Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated with antigens. Ophiopogonin D (OP-D), a purified component extracted from the plant Ophiopogon japonicus, has been found to be useful as a vaccine adjuvant. The problems of the low solubility and toxicity of OP-D can be effectively overcome by using a low-energy emulsification method to prepare nanoemulsion ophiopogonin D (NOD). In this article, a series of in vitro protocols for cellular activity evaluation are examined. The cytotoxic effects of L929 were determined using a cell counting kit-8 assay. Then, the secreted cytokine levels and corresponding immune cell numbers after the stimulation and culture of splenocytes from immunized mice were detected by ELISA and ELISpot methods. In addition, the antigen uptake ability in bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs), which were isolated from C57BL/6 mice and matured after incubation with GM-CSF plus IL-4, was observed by laser scanning confocal microscopy (CLSM). Importantly, macrophage activation was confirmed by measuring the levels of IL-1&#946;, IL-6, and tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) cytokines by ELISA kits after coculturing peritoneal macrophages (PMs) from blank mice with the adjuvant for 24 h. It is hoped that this protocol will provide other researchers with direct and effective experimental approaches to evaluate the cellular response efficacies of novel vaccine adjuvants.

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

The protocol presents detailed methods for evaluating whether the nanoemulsion ophiopogonin D adjuvant promotes effective cellular immune responses.

In vitro Bewertung der zellulären Aktivität des Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans Ophiopogonin D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

An Immunological Technique to Monitor Adjuvant-Mediated Cytotoxic T Lymphocyte Generation

Source: Lirussi, D. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57401">Rapid In Vivo&#160;Assessment of Adjuvant&#39;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an immunological method to monitor in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte or CTL production. A mouse is pre-injected with genetically engineered, proliferative dye-stained donor CD8+ T lymphocytes. Subcutaneous injection of ovalbumin with adjuvants generates cytotoxic CD8+ T lymphocytes that are identified post-harvesting through immunostaining and flow cytometry.

Eine immunologische Technik zur Überwachung der adjuvansvermittelten zytotoxischen T-Lymphozytenbildung

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
All mice ...

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

Zusammenfassung

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