Markierungsfreie Imaging der einzelnen Proteine abgesondert von lebenden Zellen über iSCAT Mikroskopie

ISCAT haben wir erstmals 2004 im Rahmen der Detektion und Spektroskopie von Gold-Nanopartikeln vorgestellt. In den folgenden 10 Jahren haben wir diese Technik für die Detektion und Verfolgung biologischer Nanopartikel wie Viren und kleine Proteine weiterentwickelt. Das Wesen der Technik ist, dass jedes materielle Objekt, egal wie klein, einen endlichen Auslöschungsquerschnitt hat.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist die etikettenfreie Detektion. Das bedeutet, dass wir, wenn wir empfindlich genug sind, fast alles entdecken können, wie Proteine oder Exosomen, die aus einzelnen Zellen abgesondert werden. Das Problem, bei dem man vorsichtig sein muss, ist, wie man den Streuhintergrund behandelt.

Ein großer Vorteil eines iSCAT-Mikroskops ist, dass es komplett selbst gebaut und einem vorhandenen kommerziellen Mikroskop hinzugefügt werden kann. Dies bedeutet, dass es leicht mit anderen optischen Techniken kombiniert werden kann, wie Fluoreszenz, und dies ist einer der Gründe, dass viele Gruppen jetzt auch iSCAT und verwandte Techniken verwenden. Hier nutzen wir LUZ-Zellen als Modellsystem, um den Nachweis individueller und sekretoher Proteine zu zeigen.

Diese Methode kann jedoch auch auf fast jeden biologischen Prozess auf molekularer Ebene angewendet werden. Um ein stabiles Mikroskop zu erreichen, beginnen Sie mit einem gedämpften optischen Tisch und einem starren massiven Block für die Probenstufe. Erstellen Sie eine Mikroskop-Probenstufe, die ein hohes numerisches Blendenobjektiv und eine Übersetzungseinheit enthält, die eine laterale Probenübersetzung sowie eine Änderung der Fokusposition für das Ziel ermöglicht.

Verwenden Sie einen 45-Grad-Vertikal-Kupplungsspiegel und eine 50 Zentimeter Brennweite Singlet-Linse, um das Licht eines Diodenlasers bei Wellenlänge 445 Nanometer auf die hintere Brennebene des Objektivs zu fokussieren. Diese Weitfeldlinse erzeugt einen kollimierten Strahl am Vorwärtsfokus des Objektivs, der zur iSCAT-Beleuchtungsquelle wird. Tragen Sie ein Tröpfchen Tauchöl auf das Objektiv auf und legen Sie einen Glasdeckel in die Probenebene der Mikroskopstufe.

Dies führt zu einem Strahl, der durch das Bildobjektiv nach unten reflektiert. Um den Bildweg einzurichten, führen Sie einen reflexmittelbeschichteten Strahlteiler in einem 45-Grad-Winkel relativ zum Einfallsstrahl und etwa 10 Zentimeter nach der Weitfeldlinse ein. Stellen Sie sicher, dass die Antireflexbeschichtung auf die Laserquelle zeigt.

Achten Sie darauf, wie ein dicker Strahlsplitter wird erhebliche Strahlverschiebung einführen, so dass der Laser nicht mehr in das Ziel gerade eindringen. Richten Sie bei Bedarf den Laserstrahlweg vor dem Strahlteiler neu aus, um die korrekte Ausbreitung durch das Objektiv zu gewährleisten. Um sicherzustellen, dass die Probenebene und die Kamera parfokal sind, legen Sie zunächst eine konkave Linse mit einer negativen Brennweite von 45 Zentimetern an einer Position fünf Zentimeter nach der Breitfeldlinse im einfallenden Strahlweg.

Dies führt dazu, dass ein kollimierter Strahl in die hintere Öffnung des Objektivs eintritt. Wenn der Bildschirm im reflektierenden Arm des Interferometers platziert ist, bewegen Sie das Objektiv in vertikaler Richtung, um die grobe Brennpunktposition zu finden. Das Ziel steht im Fokus, wenn der Strahl, der auf den Bildschirm trifft, kollidiert.

Entfernen Sie sowohl die negative Brennweite Linse und den Bildschirm, wenn grob Fokussierung abgeschlossen ist. Fügen Sie eine zweite 50 Zentimeter Brennweite Singlet-Linse hinzu, um das Streulicht zu fokussieren und das reflektierte Licht zu kollimieren. Stellen Sie sicher, dass die Linse 50 Zentimeter von der hinteren Brennebene des Objektivs entfernt platziert wird, so dass der übertragene Laserstrahl wieder kollimiert wird.

Um die iSCAT-Setup-Baugruppe abzuschließen, legen Sie die CMOS-Kamera 50 Zentimeter vom 50 Zentimeter brennweiten Objektiv entfernt und positionieren Sie den Strahl direkt auf der Mitte des Chips. Um zusätzliche Bildverarbeitungskanäle einzurichten, koppeln Sie die Ausgabe einer LED-Lichtquelle in ein Ziel über lange Arbeitswege. Installieren Sie mechanische Komponenten über der Probenkammer, die eine Fokussierung und seitliche Positionierung des LED-Ausgangs auf die Probe ermöglichen.

Verschieben Sie das obere Ziel seitlich, sodass das obere Breitfeldziel und das untere iSCAT-Ziel kolinear sind. Dies wird bestimmt, indem ein Bildschirm unter das untere Ziel gesetzt und die Intensität des übertragenen LED-Lichts auf dem Bildschirm maximiert wird. Platzieren Sie nun einen 550 Nanometer kurzen Dichroipspiegel, um das übertragene LED-Licht vom iSCAT-Laserpfad zu trennen.

Teilen Sie diesen Strahl in zwei Kanäle mit einem acht Prozent reflektierenden, 92 Prozent transmissiven Strahlteiler. Der 92-Prozent-Pfad ist der Fluoreszenzkanal, und der Acht-Prozent-Pfad wird für die Bildgebung in hellen Felden verwendet. Stellen Sie den Hellfeldkanal mit einem fünf Zentimeter langen achromatischen Doublet-Objektiv auf eine CMOS-Kamera.

Stellen Sie den Fluoreszenzkanal mit einer fünf Zentimeter langen achromatischen Doppellinse auf eine separate CMOS-Kamera. Verwenden Sie auch einen 600 Nanometer Langpassfilter, um das Anregungslicht zu blockieren. Um den Computer und die Software einzurichten, schließen Sie alle Kameras an einen Computer an.

Beobachten Sie bei der komplett montierten Einrichtung das iSCAT-Bild auf der CMOS-Kamera und stellen Sie sicher, dass es im Fokus steht, indem Sie ein Reststaub- oder Schmutzpartikel auf dem Glasdeckel finden. Stellen Sie sicher, dass es sich bei dem Bild des Partikels um eine kreisförmig symmetrische Punktstreufunktion handelt. Die Punktstreufunktion hat keine kreisförmige Form, wenn der Laserstrahl in einem leichten Winkel in das Mikroskopobjektiv eintritt.

Dies kann durch eine leichte Einstellung des 45-Grad-Spiegels korrigiert werden, um eine direkte Kopplung in das Objektiv zu gewährleisten. Vergleichen Sie die Kamerabilder des HellenFeldes und der Fluoreszenzkanäle. Stellen Sie sicher, dass beide im Fokus stehen, und zeigen Sie denselben Bereich an, indem Sie eine fluoreszierende Perle oder Zellprobe bebildern.

Überprüfen Sie, ob sich die Position des iSCAT-Lasers ungefähr in der Bildmitte befindet, und notieren Sie sich deren Position für eine spätere Referenz. Um die Position und das Sichtfeld des Hellfeldes und des Fluoreszenzkanals zu ändern, bewegen Sie die Kameras auf dem Tisch in Bezug auf die Fokussierlinsen. Bereiten Sie sich auf das Experiment vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Dazu gehören die Vorbereitung der Zellen und mikroskopischen Mittel sowie die Mikroskop-Probenküvette. Stellen Sie sicher, dass der Laserstrahl blockiert ist, um zu verhindern, dass die Zellen direkt dem iSCAT-Laserlicht ausgesetzt werden. Injizieren Sie etwa drei Mikroliter der vorbereiteten Zellprobe leicht aus der Mitte in die Probenküvette.

Berühren Sie die Pipettenspitze vorsichtig auf den Deckelund und injizieren Sie die Zelllösung langsam. Lassen Sie die Zellen auf dem Coverslip absetzen. Überprüfen Sie die Anzahl der Zellen in der Nähe des iSCAT-Lasers.

Wenn die Anzahl der Zellen zu niedrig ist, wiederholen Sie diesen Schritt, bis eine ausreichende Anzahl verfügbar ist. Wenn die Abdeckung der Zellen zu dicht ist, verwenden Sie eine Injektion von etwa 20 Mikroliter zusätzlichem Mikroskopiemedium, um die Zellen über den Deckelzuschlag zu dispergieren. Verschieben Sie das Beispiel mithilfe der piezoelektrischen Übersetzungsstufe seitlich, um eine Zelle in der Nähe des iSCAT-Ansichtsfeldes zu positionieren.

Stellen Sie sicher, dass die Zelle nicht in das iSCAT-Sichtfeld gelangt, da die direkte Exposition gegenüber dem 445 Nanometer Laserlicht für die Zelle schädlich sein könnte. Entsperren Sie den iSCAT-Laserstrahl und stellen Sie sicher, dass die Deckslip-Oberfläche weiterhin im Fokus steht. Schließen Sie den Isolationstisch ein, um Drift und akustische Kopplung aus der Umgebung zu minimieren.

Starten Sie die Messung, indem Sie Bilder von iSCAT-, Hellfeld- und Fluoreszenzkameras erfassen. Überprüfen Sie regelmäßig die Lebensfähigkeit der Zelle und den Fokus des Systems. Hier wird zur Anzeige der Kamerabilder eine selbstgeschriebene Mikroskopsoftware verwendet.

Hierbei erfolgt die Differentialbildgebung in Echtzeit durch Subtraktion konsekutierter Frames, um Proteinbindungen sichtbar zu machen. Dies führt zu einem gefilterten Bild, das zusammen mit dem rohen Kamerabild auf dem Bildschirm sichtbar ist. Repräsentative Ergebnisse eines zellulären Sekretionsexperiments, das mit iSCAT durchgeführt wurde, werden hier gezeigt.

Das Video zeigt Sekrete einer LAZ-Zelle im Laufe von zwei Minuten. Differenzielle iSCAT-Bilder auf der linken Seite visualisieren die Absorption einzelner Proteine in das Deckglas. Die Hellfeldbilder und der Fluoreszenzkanal auf der rechten Seite werden zur Überwachung der Zelllebensfähigkeit verwendet.

Dieses Histogramm zeigt die nachgewiesenen Proteine und ihren Kontrastbereich innerhalb dieses Zeitraums von zwei Minuten. Die Daten wurden durch die Analyse einzelner Bindungsereignisse in jedem Frame der iSCAT-Videodaten mithilfe eines benutzerdefinierten Peak-Suchalgorithmus gesammelt. Die ISCAT-Mikroskopie ist nicht nur ein leistungsfähiges Werkzeug in der Biosensie, sondern auch in der Mikroskopie, da sie eine etikettenfreie Detektion von Nanoobjekten in Echtzeit ermöglicht.

Insbesondere kann es auf eine Vielzahl von Prozessen wie Diffusion und Transport von Proteinen angewendet werden. Aufgrund seiner exquisiten Empfindlichkeit gegenüber Lichtstreuung kann iSCAT jedes Protein oder jede Entität im Sichtfeld erkennen. Natürlich bedeutet dies auch, dass die Technik die Spezifität fehlt, die Fluoreszenz mit sich bringt, aber um dieses Problem zu umgehen, kann man zusätzliche Methoden wie die Oberflächenfunktionalisierung anwenden, um bestimmte Proteine von Interesse zu erkennen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern gefährlich sein kann, und ein entsprechender Augenschutz sollte immer bei der Montage und Einstellung des Mikroskops getragen werden. Die Echtzeit-Erkennung von Sekretomen ist sehr spannend und ein großer Sprung in der medizinischen Diagnostik, die derzeit viel längere Zeit in Anspruch nimmt und sehr weit von einer einzigen Proteinempfindlichkeit entfernt ist. Es gibt noch viel Raum, um die Leistung der Methode zu verbessern und ihre Anwendungen zu erweitern.

Wir hoffen also, dass dieses Video anderen Gruppen hilft, sich dieser spannenden Anstrengung anzuschließen.